SND1蛋白与PML蛋白相互作用在APL中促进白血病细胞增殖和抑制分化作用机制的研究

Acute promyelocytic leukemia (APL), which is a special type of acute myeloid leukemia, is characterized by t (15;17) translocation leading to the formation of the promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor α (PML-RARα) or RARα-PML fusion protein. The resulting fusion protein leads to loss of PML. The loss of PML was found to result in a resistance to apoptosis,increased cellular growth rates, a block in myeloid cell differentiation and leukemogenesis. It has been reported that STAT6 can negatively regulate the expression of PML. Our preliminary studies showed that SND1 exists in STAT6 transcript complexes, and enhances STAT6 transcriptional activity through the RNA polymerase II. Preliminary study of our group also showed that SND1 may enhance proliferation and inhibit differentiation of APL leukemia cells, and negatively regulate the proliferation and differentiation-related molecules-PML. In this project, we choose leukemia cells to explore the effect of SND1 on proliferation and differentiation of APL cells and molecular pathways. We utilize techniques of interference with specific shRNA or overexpression of SND1 to measure the influence of SND1 on proliferation and differentiation of leukemia cells; Co-Immunoprecipitation and ChIP to observe the interaction between SND1 and PML; multicolor fluorescent labeling to observe the location of SND1 and its complexes in leukemia cells. SND1 is a breakthrough point to explore new treatment strategies for controlling dysfunction of proliferation and differentiation in APL cells.

急性早幼粒细胞白血病（APL）是一种特殊类型的急性髓系白血病，由于15，17号染色体易位出现了PML-RARα或RARα-PML融合蛋白，使得PML功能丧失，髓系细胞的分化阻滞并无限增殖，导致APL的发生。有文献报道STAT6能负性调控PML的表达。本课题组前期研究发现SND1存在于STAT6转录复合物中，通过连接RNA聚合酶Ⅱ增强STAT6的转录活性。本课题组也发现SND1与白血病细胞的增殖分化相关，并与增殖和分化相关分子PML之间存在负性调控的关系。本项目将以白血病细胞为研究对象，分析SND1对APL细胞增殖和分化的作用及其分子途径。采用特异性shRNA干扰或过表达观察SND1对白血病细胞增殖和分化的影响；用免疫共沉淀和ChIP等方法观察SND1与PML的相互作用；用多色荧光标志观察SND1及及其复合物在细胞内的定位。以SND1为切入点，探求控制白血病细胞增殖和分化障碍的治疗新策略。

我们研究发现1. 检测急性髓系白血病患者治疗前骨髓单个核细胞中SND1的表达水平，发现在具有PML/RARα融合基因阳性表达的M3型白血病患者的骨髓单个核细胞SND1表达水平较高，检测几种不同的白血病细胞系，结果表明SND1蛋白在NB4细胞系（M3髓系白血病细胞系）中表达水平显著较高。2. 我们进一步研究发现下调SND1蛋白的表达抑制了NB4细胞系的增殖能力。用全反式维甲酸（ATRA）诱导NB4细胞系分化，在分化成熟的过程中，SND1蛋白的表达水平逐渐降低，PML的表达水平逐渐增加，PML-RARα的表达水平逐渐降低。3. 应用已建立的SND1蛋白降表达的NB4白血病细胞株为实验对象，流式细胞仪检测细胞增殖水平，结果表明SND1表达水平降低后，NB4白血病细胞增殖水平降低，并且sh SND1与野生型NB4细胞增殖水平具有明显统计学差异。 4. 流式细胞仪检测细胞分化水平，结果表明SND1表达水平降低后，NB4白血病细胞群中CD11b的表达水平升高（p<0.05），用ATRA诱导后下调SND1的NB4细胞CD11b的表达水平要高于对照组NB4细胞群的CD11b表达水平。 5. 细胞周期检测发现SND1表达水平降低后G0-G1期细胞百分比增加，S期细胞百分比减少。Western blot结果表明下调SND1表达水平后，细胞周期蛋白cyclinA表达水平减低，CDK2表达水平减低。用ATRA处理后发现细胞周期蛋白cyclinA表达水平减低，CDK2表达水平减低，且下调SND1的NB4细胞与空载体对照组cyclinA与CDK2表达水平并无明显差异。说明下调SND1能够抑制细胞增殖，使细胞周期停滞，但作用没有ATRA明显。6. 结果提示SND1与PML之间存在着负性调控的关系。我们前期研究发现SND1能够激活STAT6介导的基因转录。有文献报道Pml的启动子区ISRE和GAS位点是stat家族的结合位点。而STAT家族成员中的STAT6能够下调PML的表达，那么SND1与PML之间存在着负性调控的关系，可能与SND1募集转录抑制复合物(N-CoR/HDAC)，竞争结合PML上游的转录因子，使PML的功能受到抑制。CoIP实验结果显示SND