APL细胞中PML/RARα融合蛋白调控组织因子转录的分子机制研究

出凝血异常是以PML/RARα融合蛋白为主要病因的急性早幼粒细胞白血病(APL)的临床特征之一和重要致死原因。组织因子（TF）在APL细胞上的表达异常增高是其特征性出血的主因。前期实验在PR9细胞中证实PML/RARα融合蛋白通过非直接作用于TF启动子而上调TF表达，并定位了其作用序列。而在真正的APL细胞中PML/RARα融合蛋白是否以类似机制发挥作用目前仍不明确。本实验引入APL细胞株NB4，以诱骗寡核苷酸（"诱饵"）技术为主要实验方法，根据前期实验所确定之PML/RARα融合蛋白作用位点设计合成特异"诱饵"，通过电转、RT-PCR、IP、质谱等技术，观察"诱饵"及突变"诱饵"在NB4细胞中对TF转录的影响，尝试利用"诱饵"在NB4细胞中捕获和分析与TF启动子直接作用的转录因子（复合物），实验结果将有利于进一步完整解释APL临床出血征象的分子机制，为APL出血症状的控制提供新的思路。

APL是以产生PML/RARα融合蛋白为主要特征，其常合并DIC，约80%的APL患者就诊时已有明显出血症状，因凝血障碍所导致的病人早期病死率可达30%。PML/RARα融合蛋白所致的病理性幼稚细胞上组织因子（TF）表达的异常增高是最主要的原因。但目前对PML/RARα融合蛋白与TF启动子之间的相互作用的分子机制阐述尚不完整。前期研究中，我们已证实在急性单核细胞白血病细胞株（U937-PR9）中， PML/RARα融合蛋白通过与组织因子（TF）启动子-247～-230区域间接结合而上调TF表达，而本项目则是前期实验的延续，为进一步阐明其调控机制。. 诱骗寡核苷酸“诱饵”技术，是本研究的核心技术。该技术是在体外人工合成模拟目标转录因子靶基因上启动子顺式元件序列的小分子“诱骗”DNA，转入细胞后，能竞争性地抑制靶基因启动子与转录因子的结合，降低其转录活性，从而抑制目的基因的表达。前期实验已明确TF启动子受PML/RARα融合蛋白调控，并确认了其调控位点，因此，模拟TF启动子-247～-230的序列，人工合成双链DNA“诱饵”。将“诱饵”转入相关细胞后，通过流式细胞术监测转染效率并确定最佳电转浓度；随后，通过Real-time PCR和ELISA等技术比较转染前后TF基因及蛋白表达水平的变化。实验中发现电转入特异性”诱饵”后，TF表达受到较明显的抑制，提示特异性“诱饵”在细胞内可能与TF启动子竞争结合转录因子（复合物），引起TF表达的下调。在进一步确认TF启动子受调控序列的同时，为下一步捕获未知转录因子（复合物）打下坚实的基础。. 随后，实验小组尝试利用免疫沉淀（IP）和亲和层析等方法去捕获与TF启动子直接的转录因子（复合物），并用质谱分析技术查找关联蛋白。在后期的实验中已获得一些线索，发现了一系列疑似蛋白（如PARP-1等），但是还需要进一步的实验去筛选、明确和证实直接作用转录因子。. 本研究旨在前期实验的基础上，进一步阐明PML/RARα融合蛋白上调TF表达的相关分子机制。项目的实行将有利于解释APL临床严重出血征象的分子机制，并有望探索针对诱导性TF高表达及临床严重出血的靶向抑制的方法。