反义非编码RNA调控淋巴细胞CD45亚型表达的研究

The expression of leukocyte common antigen CD45 splicing isoforms is closely correlated with the function of lymphocytes and pathogenesis of autoimmune diseases. The DNA methylation and binding factors played an important function in the alterative splicing of CD45 isoforms. We found that there was a natural transcript on the antisense strands of CD45, and knocking down CD45 antisense RNA resulted the changed expression of CD45 isoforms. Based on this feature and our previous research results that antisense RNA regulated the gene expression in epigenetic level, we proposed a hypothesis that CD45 antisense RNA regulated the expression of CD45 alternative splicing isoforms through DNA methylation, and that might be involved in control of lymphocytes function in clinical patients suffering from autoimmune disease. To confirm this hypothesis, the cultured lymphocytes and peripheral blood cells in patients with systemic lupus erythematosus were applied as research model to investigate the regulatory function of antisense RNA on the alternative splicing of CD45 and to explore the possible mechanism of the regulation. Same time, this study also aims to provide research basis for the clinical study of the pathogenesis of systemic lupus erythematosus.

白细胞共同抗原CD45剪接亚型的表达与淋巴细胞功能调节以及系统性红斑狼疮等自身免疫病的发病密切相关，CD45基因的DNA甲基化状态以及转录因子的结合对其剪接亚型的表达具有重要调控作用。我们发现CD45基因的反义链上存在自然反义转录本，干扰反义RNA能导致CD45亚型表达的改变。结合课题组前期关于反义RNA在表观遗传学水平调控基因表达的研究基础，我们提出“反义非编码RNA通过DNA甲基化调节CD45剪接亚型的表达，并可能参与自身免疫病患者淋巴细胞功能状态调控”的假说。本课题以培养的淋巴细胞以及临床系统性红斑狼疮患者外周血细胞为研究对象，检测分析反义RNA与CD45亚型的表达以及系统性红斑狼疮发病之间的相关性，探讨反义RNA调控CD45选择性剪接的可能作用机制，并为临床研究系统性红斑狼疮的发病机制提供科学依据。

项目基于课题假说CD45反义RNA可能通过DNA甲基化调控淋巴细胞CD45的剪接亚型并可能与临床自身免疫病的发病相关，按照申报书计划开展研究。在项目实施过程中：首先通过生物数据库分析CD45反义转录本PEBP1P3与CD45表达的相关性，发现大部分组织中二者的表达正相关，提示可能存在调控关系；进一步在培养的淋巴细胞中通过克隆测序以及细胞成分分离鉴定分析了CD45自然反义RNA的序列、非编码特点及其在细胞内的定位和表达水平；通过RNA干扰敲降淋巴细胞CD45反义RNA的表达，检测CD45亚型表达的改变，以及反义转录本对应的CD45内含子2以及选择性外显子位置的DNA甲基化水平；结合CD45正义序列与反义转录本的位置对应关系，考虑染色质空间构像可能参与调节，进而通过大数据和染色质免疫沉淀发现转录因子CTCF在CD45内含子2以及外显子5的结合峰值，提示CTCF可能介导染色质环形成参与反义RNA对CD45的调控作用。另外，针对CD45亚型与临床与自身免疫病发病的相关性分析发现，系统性红斑狼疮患者体内CD45RO的表达高于CD45RA，并且患者体内性激素水平和免疫因子水平与对照相比具有明显差异；体外实验通过雌二醇作用淋巴细胞验证了雌激素对CD45亚型的调节作用，序列分析发现在CD45反义转录本上存在雌激素反应元件，提示有可能雌激素通过CD45反义RNA进而介导CD45亚型表达的调控作用，该结果与临床女性自身免疫病高发病率一致。总之，以上结果初步揭示了CD45反义RNA通过表观遗传学机制调控CD45选择性外显子的剪接的作用和机制，也为今后进一步从基础和临床探究CD45亚型表达和免疫相关功能的调控提供了基础。