草坪草币斑病病原菌对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药性检测及抗性机理研究

The dollar spot, caused by Sclerotinia homoeocarpa, is an important turfgrass disease that infects almost all turf species worldwide. Because of unreasonable fungicide usage in filed, the sensitivity of S. homoeocarpa to most of fungicides especially for dicarboximidae (DCFs) gradually decreased. The development of fungicide resistance not only increases the difficulty of turfgrass diseases management, but also brings lots of serious environment problems with more fungicides application. The improving resistance of S. homoeocarpa strains to DCFs fungicides have been widely documented in worldwide, however, the resistance mechanism is still unclear and there is no fungicides resistance study on turfgrass in China. The project will focus on fungicides resistance of S. homoeocarpa and explore the DCFs resistance of S. homoeocarpa isolates collected from Hainan province and the effects of fungicide application date, application frequency and amount on the resistance of S. homoeocarpa. Based on these selection, the biology and molecular characteristics of S. homoeocarpa isolates with different resistance level will be evaluated and the gene loci interacted with DCFs will be identified by aids of gene knocking technology to clarify the current resistance situation of field S. homoeocarpa to DCFs and molecular resistance mechanisms. This study will provide the theory basic for reasonable design and guide the chemical control of dollar spot.

币斑病 (Sclerotinia homoeocarpa)是全球范围内可危害几乎所有草种的重要草坪草病害。由于田间杀菌剂的不合理使用，币斑病病原菌对二甲酰亚胺类杀菌剂 (DCFs)的敏感性逐步降低，抗性问题的发展，不仅增加了草坪草病害管理工作的难度，同时对环境造成十分恶劣的影响。然而其抗性机理至今仍不清楚，我国亦没有在草坪上开展抗药性检测相关方面的工作。本项目以草坪草币斑病病原菌为研究对象，在我国海南省开展币斑病病原菌对DCFs敏感性检测，揭示药剂使用年限，施用频率，施用量对病原菌抗药性发展的影响；研究不同抗性水平菌株的普通生物学和分子生物学特征，明确抗性菌株环境适应性机制与基因突变位点；并通过基因敲除技术分析币斑病病原菌双组分组氨酸激酶基因功能与抗药性的关系。研究结果将有助于了解我国币斑病病原菌对DCFs抗药性现状，揭示其抗性分子机理，以期为科学合理的制定币斑病化学防治方法提供理论依据。

币斑病 (Sclerotinia homoeocarpa)是全球范围内可危害几乎所有草种的重要草坪草病害。不合理的化学防治措施致使币斑病病原菌抗性群体迅速增长。本研究从海南省9个不同高尔夫球场收集了668个菌株用于对甲基托布津，丙环唑和异菌脲3种不同类型杀菌剂的室内抗药性检测。币斑病菌对甲基托布津，丙环唑和异菌脲敏感性基线分别为 0.3489 µg/ml–1，0.0037 µg/ml–1和0.2234 µg/ml–1。与币斑病菌敏感群体相比，测试的19个群体中有18个群体和17群体分别对丙环唑和异菌脲敏感性降低；有5个群体对甲基托布津敏感，2个群体全部产生抗性，剩余12个群体抗性比例从3.57 至 80.95 %不等。从果岭收集的菌株对各类药剂敏感性显著低于球道和高草区收集的菌株。二甲酰亚胺类杀菌剂(DCFs) 不同抗性水平菌株生物学特性测定结果表明室内诱导抗性菌株对高渗透压，过氧化氢适应性以及对海滨雀稗的致病力较田间抗性菌株和野生型菌株均有所减弱，表明其环境适应性减弱。通过币斑病菌抗性和敏感菌株β-tubulin基因比对分析发现，当菌株产生中抗时该基因编码的第200位密码子由苯丙氨酸 (TTC)突变为酪氨酸(TAC) (F200Y)，当198密码子由谷氨酸(GAG)突变为丙氨酸(GCG) (E198A)时，菌株则表现为高抗。本研究建立了一种循环介导等温扩增(LAMP) 反应体系用于快速检测甲基托布津高抗菌株。试验表明该LAMP检测体系具有良好的特异性、敏感性、稳定性和重复性，可准确用于田间检测甲基托布津高抗菌株。通过比对抗性和敏感性菌株Shos1基因发现，田间DCFs抗性菌株在1267位密码子处发生点突变 (由丝氨酸突变为脯氨酸)，而在敏感和室内耐药突变体中无突变。为了进一步明确Shos1的功能，本研究使用聚乙烯乙二醇介导的原生质体转化获得Shos1突变体(S1267P)，该突变体获得DCFs抗药性。综上所述，该项目的研究结果可为科学合理的制定币斑病化学防治方法提供理论依据。