基于ERM蛋白研究流感病毒所致肺微血管内皮细胞通透性升高的分子机制及中药的干预

肺微血管内皮细胞（PMVEC)损伤、通透性升高是流感病毒性肺炎重要的病理基础。ERM蛋白是细胞膜蛋白与胞内骨架蛋白的连接蛋白，在血管通透性调节中起重要作用，p38-MAPK、PKC、Rho/ROCK信号途径均以ERM为底物参与PMVEC通透性调控，因此，本课题在前期实验基础上，以流感病毒诱导大鼠原代PMVEC及流感病毒性肺炎小鼠模型为研究对象，以ERM蛋白及其上游信号通路为切入点，分析流感病毒所致PMVEC通透性升高的具体信号分子机制，并从病络论治，观察具有清热解毒、凉血止血、化瘀通络功效的经典合方犀角地黄汤合银翘散的干预效应，以及对ERM蛋白表达和p38-MAPK、PKC、Rho/ROCK信号途径的影响，揭示该方改善 PMVEC通透性的作用环节与整合调节机制，为此类中药在病毒性肺炎临床治疗的应用中提供实验依据与基础。并为诠释病毒（外邪）损伤肺络致病提供病理生理学基础。

重症流感病毒感染常出现急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS），导致较高的死亡率。流感病毒性肺炎中肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC）屏障功能破坏，通透性增加是导致肺水肿，继发ALI、ARDS的主要病理基础。埃兹蛋白（Ezrin）/根蛋白（radixin）/膜突蛋白（moesin）（ERM）是细胞膜蛋白与胞内骨架蛋白的重要连接蛋白，参与了多个信号转导的过程，在血管通透性调节中起重要作用。本研究结果表明，流感病毒感染PMVEC后，能引起F-actin重构，内皮细胞通透性明显增加，并伴有细胞内磷酸化ERM表达增强，从胞浆到胞膜的移行；流感病毒感染PMVEC中，存在p38-MAPK、PKC、Rho/ROCK信号通路的明显活化；p38MAPK、Rho/ROCK和PKC信号通路抑制剂显著下调了p-ERM水平，抑制了p-ERM、F-actin的重构，降低了流感病毒感染所致PMVEC通透性的升高，说明p38MAPK，Rho/ROCK和PKC信号通路的活化可通过磷酸化ERM蛋白参与流感病毒诱导的PMVEC中F-actin的重构及通透性的升高。. 犀角地黄汤合银翘散是源自清代吴鞠通的经典合方，具有清热解毒、凉血止血、活血散瘀之功效，临床可用于治疗重症病毒性肺炎。本研究制备了临床等效剂量（13.8 g/ kg）的犀角地黄汤合银翘散含药血清，作用于体外流感病毒感染的PMVEC中，证实了犀角地黄汤合银翘散能明显减轻流感病毒感染PMVEC中F-actin向胞浆的聚集；犀角地黄汤合银翘散明显抑制流感病毒感染PMVEC中p-ERM表达的升高以及p-ERM的重构。通过进一步检测犀角地黄汤合银翘散对ERM磷酸化的上游通路的影响，证实犀角地黄汤合银翘散可明显抑制流感病毒感染PMVEC中p-MKK、p-p38、ROCK1、及p-PKC的表达，说明犀角地黄汤合银翘散可通过抑制流感病毒感染PMVEC中p38MAPK、Rho/ ROCK、PKC通路的活化，减少p-ERM的表达，从而抑制p-ERM及F-actin的重构。. 本研究解析了病毒作为“外邪”引起肺络（肺微血管）损伤的分子机制及犀角地黄汤合银翘散改善PMVEC通透性的分子机制，为其临床应用中提供实验依据与基础。