SMPDL3A激活介导鞘磷脂生成减少参与肝癌发生发展的机制研究

Abnormal activation of oncogenes is one of the major causes of the occurrence and development of hepatocellular carcinoma (HCC). It is significant to explore and study the abnormal expression of novel genes and their biological functions in revealing the pathogenesis of HCC, developing new therapeutic drugs and judging prognosis. Our previous study showed that SMPDL3A is a novel oncogene that can promote proliferation of HCC cell and inhibit its apoptosis. Besides，interference of SMPDL3A expression can promote the production of sphingomyelin (SM) in HCC cells. The possible mechanism is that SMPDL3A expression is regulated by transcription factor HIC1 and interacts with sphingomyelin synthase (SGMS) leading to the decrease of SM, which results in the occurrence and development of HCC. We intend to investigate the transcriptional regulation of SMPDL3A by HIC1, the biological function of SMPDL3A in HCC, and the interaction between SMPDL3A and SGMS which influences SM production through molecular, cellular, animal models and clinical samples. This study aims to elucidate the transcriptional activation of SMPDL3A, biological function of SMPDL3A and its specific molecular mechanism that will provide a new idea for the clinical diagnosis, treatment and prognosis in HCC.

癌基因的异常激活是导致肝癌发生与发展的重要原因之一。探索并研究肝癌中新基因的异常表达及其生物学功能，对揭示肝癌的发病机制，开发新的治疗药物以及预后判断都具有重要的指导意义。课题组前期研究显示SMPDL3A是一个可以促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡的新癌基因，并且干扰SMPDL3A表达可以促进肝癌细胞中鞘磷脂（SM）的生成。其机制可能是SMPDL3A表达受转录因子HIC1的调控，并与鞘磷脂合酶（SGMS）相互作用导致肝癌细胞中SM生成减少，从而促进了肝癌的发生发展。项目组拟通过分子、细胞、动物模型和临床样本等多角度，探讨HIC1对SMPDL3A的转录调控，SMPDL3A在肝癌中的生物学功能，以及SMPDL3A与SGMS的相互作用影响SM生成的分子机制。本研究旨在阐明SMPDL3A基因的转录激活，及其在肝癌中的生物学功能和具体作用机制，为肝癌的临床诊治及预后判断提供新思路。

目的 .肝细胞癌是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一。研究肝癌中新的功能基因及其影响肝癌发生发展的分子机制，对揭示肝癌的发病机制及预后判断都具有重要的指导意义。.研究内容.1. Affymetrix表达谱芯片筛选VCAD1基因敲降后的差异基因；.2. 组织芯片研究SMPDL3A在肝癌组织中的表达和肝癌患者预后的关系；.3.利用Crispr-Cas9慢病毒敲除肝癌细胞系中的SMPDL3A。采用平板克隆形成实验和CCK8实验检测对细胞细胞增殖能力的影响。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。TUNEL法和流式细胞仪检测肿瘤细胞的细胞凋亡；.4. SMPDL3A在体内促进了肿瘤的生长；.5. 研究与SMPLD3A相互作用的分子。.重要结果 .1. VDAC1敲降后有205个上调的mRNA和347个下调的mRNA。选取了其中31个有代表性的差异基因进行进一步的qPCR验证。使用高内涵筛选的方法，发现SMPDL3A敲降对肝癌细胞系增殖抑制作用最大。选取SMPDL3A进行后续研究。.2. 肝癌患者癌组织和癌旁组织中SMPLDL3A分子的表达存在差异，SMPDL3A高表达组的患者总生存率和无瘤生存率显著低于低表达组。SMPDL3A的表达水平与PIVKA-II、肝硬化、肿瘤直径、微血管侵犯、BCLC分期密切相关。SMPDL3A是影响肝癌患者术后总生存率和无瘤生存率的独立危险因素。.3. 体外实验研究敲除SMDPL3A基因对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响。CCK-8和克隆形成实验显示sgSMPDL3A 抑制肝癌细胞增殖；划痕实验提示sgSMPDL3A组肝癌细胞迁移受到抑制；流式细胞仪和TUNEL实验提示sgSMPDL3A促进肿瘤细胞凋亡。.4.体内实验在裸鼠皮下肿瘤形成中sgSMPDL3A抑制了肿瘤的生长，裸鼠皮下肿瘤组织中Ki67和PNCA的免疫组化分析也提示sgSMPDL3A组肿瘤增殖被抑制。.5.通过免疫组化联合质谱分析发现可能与SMPDL3A相互作用的蛋白，Co-IP验证SMPDL3A与ERH存在相互作用。CCK8实验验证SMPDL3A通过ERH参与肝癌增殖调控。.科学意义：SMPDL3A高表达与肝癌患者不良预后相关，可作为影响患者无瘤生存率和总生存率的独立危险因素。敲除SMDPL3A能抑制肝癌细胞的增殖和迁移，加速细胞凋亡。SMPDL3A与ERH存在相互作用，影响肝癌发展。