载VEGF纳米粒子联合肝细胞移植对肝血管新生影响及机制研究

目前，如何促进肝衰竭后肝再生尚无理想方法。肝血管新生和肝窦重建是肝再生的前提。血管内皮生长因子（VEGF）对其起重要作用，但临床静脉使用VEGF治疗肝衰竭效果不佳。载药纳米技术的应用为其提供了新的治疗途径。项目组在前期研究基础上，拟通过制备载VEGF的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子，进行肝细胞移植（HTx），利用纳米材料的促细胞分化功能和载药纳米粒子的缓释性、靶向性，充分发挥VEGF的作用，促进受体肝血管再生。本项目通过观察移植后受体存活率和血管密度、肝增殖指数、VEGF基因表达等指标，评估载VEGF纳米粒子HTx后肝衰竭大鼠肝血管新生和肝组织重构情况，探讨载VEGF纳米粒子作用效能、作用机理和血管新生疗法用于肝衰竭治疗的可能性。

急性肝衰竭（ALF）常规内科治疗效果不佳，死亡率高。项目组通过制备载血管内皮生长因子（VEGF）的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子，进行肝细胞移植（HCT），利用纳米材料的促细胞分化功能和载药纳米粒子的缓释性、靶向性，充分发挥VEGF的作用，促进受体肝血管再生。 . 本项目采用D-氨基半乳糖法制备大鼠急性肝衰竭模型，载VEGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的肝细胞进行移植，检测血管数量、微血管密度、促血管生成素-2（Ang-2）蛋白的表达，了解受体肝血管新生情况。通过PCR法检测HGF mRNA和VEGF mRNA的表达，了解其与肝细胞和肝血管新生的关系，通过对细胞因子网络的研究，更好了解受体肝再生的机理。.项目组制备了载HGF、VEGF纳米粒子、建立了ALF模型，采用原位两步灌流法分离雄性大鼠肝细胞，载生长因子纳米粒子体外培养肝细胞并进行实验分组。将载生长因子纳米粒子培养的雄性大鼠肝细胞移植到ALF雌性大鼠腹腔内作为实验组，以正常雌性大鼠作为对照。肝细胞移植后不同时间取受体大鼠肝脏等组织。克隆雄性大鼠SRY基因片段，并采用DIG进行探针标记。通过标记的Y染色体基因探针与移植的雄性大鼠的细胞原位杂交显像，检测各组大鼠肝脏组织和周围脏器中移植细胞的分布情况，并与正常雌性大鼠的相应部位对比。. 结果：采用改良超声乳化法制得的载生长因子的PLA-O-CMC纳米粒子具有较为光滑的表面形貌和相对均一的粒径分布；载药率为0.10475%，包封率为71.28%，达到预期结果。实验组雌性大鼠的肝脏、脾、肺、肾在HCT后1~14天，脏器内部实质部分均未见有被染成紫蓝色的细胞。移植的肝细胞所形成的肝细胞团块中可以见到阳性细胞广泛分布。各移植组存活率好于对照组。. 结论：腹腔移植的肝细胞定植于腹腔，未发现迁移到其他的脏器。载生长因子纳米粒子肝细胞移植组肝功能指标好于空白纳米粒子肝细胞移植组，肝脏VEGF的表达量及MVD计数均高于空白纳米粒子组。该方法可提高ALF大鼠的生存率，肝细胞腹腔移植后未发现移植细胞迁移到原位患肝和其它内脏器官的情况。研究提示载生长因子纳米粒子肝细胞移植治疗肝衰竭的作用机制并非通过细胞迁移而更多可能通过生长因子缓释和肝血管新生等而起作用。