耳聋左慈丸对老年性聋内毛细胞带状突触递质释放作用机制的研究

Prescubysis has been considered as a critical clinical problem because of its multifactor and multi approach, irreversibility. It has been proved the reduce of neurotransimitter release of ribbon synapse in cochlea inner cells (IHCs).Recently, the role of Erlong Zuoci pill which is a traditional Chinese medicine compound in treatment of precubysis is becoming an important issue, some clinical studies have provided it as an effect medicine, which rise function of reducing OFR and protecting succinateduhydrogenase (SDH). This provided us a new insight into molecular biology mechanisms. In our study, we plan to select basic C57BL/6J mice as animal models. Mice will be divided into two groups: the control group and the experimental group. We will feed mice of experimental group with Erlong Zuoci pills, and timing is arranged at 2,4,8,12 weeks. The auditory function examinations ,immunochemistry staining, western blot and electron microscope will be applied respectively to this study at each timing. The number of ribbon synapses, the synaptic distribution along the cochlea axis, the synaptic structures and its functional alterations will be analyzed respectively. According to these analysis, we may find mechanism of Erlong Zuoci pills in presbycusis treatment in a new molecular biology way.

老年性聋由于发病的多因素、多途径及不可逆性，已成为临床治疗的一个难点问题。申请人前期研究发现内毛细胞带状突触是耳蜗损伤的首个靶器官,氧自由基增多引发线粒体代谢异常导致耳蜗内毛细胞带状突触递质释放减少是老年性聋的主要发病机制之一。通过现代药理学研究发现耳聋左慈丸的主要成分是马钱苷和丹皮酚，能起到抗氧化，保护琥珀酸脱羧酶的作用，为进一步揭示耳聋左慈丸的治疗机理提供新的线索。在本研究中我们计划采用国际通用的C57BL/6J小鼠作为老年性聋的动物模型，模拟老年性聋的病变过程。将小鼠分为两组，对照组和实验组，实验组喂食耳聋左慈丸汤。依次在2周、4周、8周、12周检测小鼠耳蜗内淋巴液中氧自由基水平，并对小鼠进行听功能测试，采用免疫组化结合激光共聚焦、电镜和膜片钳等技术手段对小鼠耳蜗内毛细胞带状突触的数量、分布、形态、结构及功能进行系统分析。从分子生物学角度明确耳聋左慈丸治疗老年性聋的机制。

随着社会老龄化进展,老年性聋成为耳鼻喉科临床治疗的一个突出问题.中医辨证认为老年性聋多属虚证，为兼顾肝肾脾虚发明了经典方剂耳聋左慈丸，人们从中分离出两大主要活性成分--马钱苷和丹皮酚,并证实这两种成分能清除细胞老化所产生的氧自由基，促进线粒体有氧代谢以保护耳蜗阻止其退行性变。这与西医观点的氧自由基理论有很多相似之处。为探索应用耳聋左慈丸后对内毛细胞及带状突触产生的作用,我们使用老年动物模型,每日灌服耳聋左慈汤，结合听力学电生理检查、蛋白组学及免疫组化技术研究耳聋左慈丸对老年性聋的耳蜗内毛细胞及带状突触的保护功能.实验结果如下:.1听功能检测:.对照组5月龄，6月龄，7月龄小鼠ABR阈值分别为18.5 ± 5.25, 45.25 ± 4.63, and 50.5 ± 6.38 dB SPL，实验组分别为21.5±1.00, 31.0± 7.5, 45.5±3.25 dB SPL, 两组对比差异有意义(p<0.05), tonebust结果显示随着年龄进展，高频听力最先出现下降，耳聋左慈汤对高频听力有保护作用。.2 Western-blot：实验组耳蜗组织中SOD含量较同期对照组明显升高，突触前及突触后表达量较对照组同期明显增加。.3 免疫组化结果：.1）耳蜗切片：SOD在5月龄小鼠的内柱及内毛细胞处沉积，随着年龄进展，对照组SOD表达量明显降低，使用耳聋左慈丸对SOD的下降有延缓作用.2）铺片：对照组小鼠三个时间点突触数量分别为15.4±4.5，12.7±3.5，11.0±5.4，实验组18.3±3.0, 17.8±7.6, 15.9±4.3, 差异有统计学意义(p<0.05).其中给药组小鼠在这12周内的自身对比显示，在给药第4周、第8周，内耳带状突触数量较第12周明显增加，提示用药早期耳聋左慈丸对内毛细胞带状突触的保护是比较明显的。.课题组在实验前期进行了部分更年长年龄小鼠进行耳聋左慈丸干预后听力学改变情况，发现在老年性聋发生之前给予药物干预对延缓听力下降有更大的帮助，而随着用药时间延长，耳聋左慈丸对听力干预的趋势呈现下降趋势，这一研究为临床治疗老年性聋提供分子生物学基础，通过这项研究证实耳聋左慈丸越早使用延缓听力下降的作用就越明显。