G-蛋白Rab3A与突触结合蛋白I的相互作用及其对突触递质释放的影响

The brain is the center for integrating information and controlling various physiological activities and behaviors. Synapses are the sites for functional connection of the neurons in brain. Many physiological and biochemical processes related to the functions of synapses, such as transmitter release and activation, transmitter receptor modulation，signal transduction cascades and so on, are all performed by the intricate network of synaptic proteins cooperatively. Therefore, a deep investigation into the synaptic proteins and their interactions is helpful to further understand the struture and function of the synapses.It has been reported that Rab3 and synaptotagmin are two critical proteins with oposite functions in the regulation of synaptic vesicle exocytosis. Our previous work demonstrated that Rab3A directly interacts with synaptotagming I and therefore affects the synaptic membrane fusion. The present project will, based on the previous work,investigate the mechnisiam of Rab3A interaction with synaptotagmin I and its roles in the regulation of synaptic transmitter release in the mammal brain synapaes using proteomic and related techniques, so as to further deepen the understanding of the molecular mechnism of synaptic transmission.

大脑是信息处理中心以及各种生理活动和行为的控制中心。突触是大脑神经元之间发生功能联系的部位，许多与突触功能有关的生理生化过程，如神经递质释放与激活、神经递质受体的调节以及信号传导级联放大等都是由突触中构成复杂网络的突触蛋白相互协调完成的。因此，深入开展突触蛋白质及其相互作用研究有助于加深对突触结构与功能的了解。据文献报道，G-蛋白Rab3和突触结合蛋白Synaptotagmin 是调节突触囊泡释放的两种具有相反作用的关键蛋白质。我们的前期工作证明，Rab3A能通过与Synaptotagmin I 的直接相互作用，影响突触膜的融合。本项目研究将在前期工作的基础上，利用蛋白质组学及相关技术研究哺乳动物大脑突触中Rab3A与Synaptotagmin I 的相互作用机理及其在突触递质释放调节中的作用，从而进一步加深对突触传递分子机制的了解。

G蛋白Rab3A和突触结合蛋白I（Synaptotagmin I，Syt I）在囊泡与突触前膜融合及神经递质释放的过程中起着重要的调节作用。但它们作用的分子机制还不完全清楚。本项目利用生物化学、分子生物学及相关实验技术对这两种蛋白质的相互作用机制及其对神经递质释放的影响等进行了较为系统的探究。.体外实验表明，Rab3A和Syt I之间能以不依赖Ca2+的方式产生直接的相互作用；Syt I C2A 结构域中Rab3A结合的关键位点为K199R200，C2B 结构域中Rab3A结合的关键位点是KKKK模体；Rab3A主要通过其N-区域与C2结构域产生相互作用。综合分析表明，Rab3A与C2结构域的相互作用涉及多种相互作用力。Rab3A 主要以竞争性作用的方式，通过影响C2A与突触前膜磷脂的结合和影响C2B与t-SNARE 复合物中突触融合蛋白的结合，从而调节Syt I介导的囊泡与突触前膜的融合和神经递质的释放。.为了进一步探究Rab3A和 Syt I的相互作用及其对神经递质释放的影响，本项目以P12细胞为模式系统，以多巴胺为主要检测指标进行了研究。结果表明，Rab3A对PC12 细胞的Ca2+依赖性和Ca2+不依赖性的多巴胺释放都有调节作用，但调节机制不同。用不同浓度（2500 nM）的Rab3A 孵育洋地黄皂苷渗透化处理的PC12 细胞导致Ca2+依赖的多巴胺释放的逐步降低，提示Rab3A是Ca2+依赖的多巴胺释放的负调节剂。用RNA 干扰的方法敲低Syt I的表达后，多巴胺的释放显著降低（P<0.05）, 说明Syt I是Ca2+依赖的多巴胺释放的促进剂。用不同浓度（2500 nM）的Rab3A 孵育Syt I敲低的PC12 细胞使Ca2+依赖的多巴胺释放进一步降低，但降低的幅度与Syt I 敲低前相比显著降低（P<0.05），提示Rab3A对Ca2+依赖的多巴胺释放的抑制作用涉及Rab3A与Syt I的相互作用。此外，相关实验结果表明，Syt I是一个多功能蛋白质，能通过与K+通道等其他多种蛋白质相互作用而参与神经递质释放及其他细胞过程的调节。本项目研究首次证明Rab3A能与Syt I直接结合；Rab3A对神经递质释放的调节作用涉及Rab3A与Syt I的相互作用，为阐明Rab3和突触结合蛋白调节神经递质释放的分子机制积累了重要的实验资料。