基于叠氮溴化丙锭染色研究亚热带分层水库存活细菌群落的时间动态变化

In recent years, the breakthrough of DNA-based high-throughput sequencing technology has significantly improved the efficiency and throughput of microbial community profiling. However, conventional DNA extraction and sequencing methods target all DNA molecules in samples and cannot distinguish between living and dead microorganisms. More attention should be given to dead microorganisms in the reservoir environment, and the impact of dead microbes on the entire microbial community is not clear. Although dead microorganisms can be used as “bioavailable nutrients” or electron acceptors for alive species, it is only the living microorganisms that have the potential to grow in, adapt to, and actively change a given environment. In this project, propidium monoazide (PMA) a photoreactive DNA-binding dye and DNA staining method will be used to label and degrade the DNA of dead microorganisms in a subtropical stratified reservoir. The 16S rDNA sequencing technique as well as multivariate statistics and model analysis methods will be utilized to distinguish alive and death bacteria, and the dynamics of dead and alive microbial communities in aquatic environments will be compared. The purpose of this project is to 1) elucidate the influence of the abundance and composition of dead microorganisms on the α and β diversity of total microbial communities; 2) reveal the contribution of dead microorganisms to spatio-temporal dynamics of the total community structure of microorganisms in different water layers. This study focuses on the composition and changes of living and dead microorganisms in the environment, which may be helpful in deeply understanding the succession process and mechanism of reservoir microbial community and provide scientific support for the formulation and optimization of reservoir management measures.

基于DNA分子的高通量测序显著提高了微生物群落检测的效率和通量，然而目前常规方法对样品中的DNA“一网打尽”，无法区分存活和死亡状态的微生物。水库环境中的死亡微生物未受到足够重视，其对整个微生物群落的影响还不明确。虽然死亡微生物可以作为“养分”或电子受体，但只有活的微生物才具有在环境中生长、适应和改变环境的能力。本研究基于叠氮溴化丙锭(PMA)染色技术，以亚热带分层水库浮游微生物为研究对象，标记并降解环境中死亡微生物DNA，利用16S扩增测序，结合多元统计和模型分析方法，对水环境中的死亡和存活微生物群落动态进行比较研究：1)阐明死亡微生物的丰度与组成对微生物总群落α和β多样性的影响；2)揭示死亡微生物在不同水层中对微生物总体群落结构时空动态的贡献。本研究聚焦环境中存活与死亡微生物的组成与变化，有助于系统深入认知水库微生物群落演替过程与机制，为制定和优化水库管理措施提供科学支持。

基于DNA分子的高通量测序技术的快速发展极大地提高了我们从各种环境样本中检测微生物群落多样性、组成和功能动态的能力，但该方法无法表征微生物群落的活性成分，即无法排除死亡微生物的干扰。区分死/活微生物具有重要的生态意义，例如识别有害藻华或活的病原微生物的存活和死亡（/阶段）以评估水质发展状态等。研究表明，细胞外无活性的DNA广泛分布于海洋、淡水、土壤、沉积物和空气以及饮用水和废水中，可能会掩盖水生生态系统中的微生物多样性和群落组成评估。为了准确地将微生物活动与其结构和功能联系起来，在基于DNA的微生物群落分析中区分死亡和存活微生物至关重要。然而，目前死亡微生物残留在环境中的DNA对基于DNA的微生物多样性评估的影响通常被忽视。在本项目中，我们使用叠氮溴化丙锭(PMA)处理结合高通量测序来表征河流-水库生态系统中活跃的微生物群落组成和网络。我们的结果表明，真核微生物群落组成对PMA处理的敏感性高于细菌群落组成。尽管在PMA处理后许多分类群的相对丰度发生了显著变化，但全部的和存活的微生物群落显示出相似的时间动态格局。PMA处理后，存活细菌和原生生物共存网络的复杂性降低，网络模块化减弱。然而，存活真菌网络的复杂性和模块性在PMA处理后增加。在PMA处理下，存活细菌-原生生物和原生生物-真菌二分网络得到简化，存活细菌-真菌共存网络较稳定。最后，与存活的微生物群落相比，总体微生物群落与环境因素的相关性更高，尤其是原生生物和真菌群落。我们的结果表明，水体中死亡微生物的DNA残留会掩盖微生物群落组成和共存网络。因此，强烈建议未来对淡水生态系统中死亡微生物DNA的含量、衰减率和功能进行深入研究。本项目在Environmental Pollution、Harmful Algae、Microbiology Spectrum、Ecotoxicology and Environmental Safety等杂志上发表相关SCI论文7篇，授权发明专利1项。