半滑舌鳎脾肾坏死症病原鉴定及其侵染、传播途径研究

Tongue Sole Spleen and Kidney Necrosis Virus (TSSKNV) which causes mass mortality of tongue sole (Cynoglossus semilaevis) is a Picorna-like virus discovered recently. On the basis of previous work, we plan to develop identification and pathogenesis research on TSSKNV by using methods of cell biology, genomics, molecular biology, virology, electron microscopy techniques and animal experiments. We will investigate the features of the disease caused by TSSKNV and observe the life cycle of TSSKNV in this research. We will complete the whole genome sequencing for TSSKNV and analysis its biological evolution. With the morphology information we will know exact phylogenic position of TSSKNV. We will rescue TSSKNV and different recombined viruses including GFP-recombined virus through Reverse Genetic System depending on the genome information. Comparing the abilities of infection, proliferation and virulence of TSSKNV and recombined viruses, we will figure out the functions of TSSKNV genes and how does TSSKNV infect host cell and which genes are essential for virulence. Virus distribution in different organs of host is another question we will search for answer in this research. We also want to understand ways TSSKNV uses for infecting and disseminating by using fluorescence microscope observation and PCR detecting methods. With above studies, we will identify the functions for 1-3 genes of TSSKNV, clarify infect procedure and transmission ways, and reveal TSSKNV pathogenic mechanisms. We have long-term study for relative work on tongue sole diseases and the members are experienced in cell culture, electronic microscope and virus research. The research findings will provide theories for tongue sole disease prevention.

半滑舌鳎脾肾坏死病毒(TSSKNV)是近年在发病半滑舌鳎中发现的一种类小核糖核酸病毒，引起发病半滑舌鳎大量死亡。本研究在前期工作基础上，开展病毒鉴定及致病过程研究：通过细胞生物学、基因组学、分子生物学、病毒学、实验动物学以及电子显微镜技术等实验手段，总结疾病发生特征，筛选敏感细胞，测序病毒的全基因组序列，确定分类地位；利用反向遗传技术拯救各种基因修饰的重组病毒，通过比较重组病毒侵染能力、增殖能力以及致病性的变化，阐述基因功能；分别建立分子生物学和免疫学检测方法，检测TSSKNV在宿主不同组织/器官的动态分布、在环境中的分布，预测其传播途径与侵染宿主途径，并通过细胞培养与动物实验验证。本研究建立在长期调查研究基础上，有完整成熟的研究方案、扎实的实验技术保障项目顺利实施。项目的研究成果对于客观认知半滑舌鳎脾肾坏死症病原，建立有效防治半滑舌鳎脾肾坏死症技术具有重要意义。

半滑舌鳎是我国重要海洋生物资源和优质养殖品种，其健康增养殖对于保护资源环境、提供优质蛋白具有重要意义。本项目在多年调查研究基础上，确定了半滑舌鳎脾肾坏死症是频繁发生并且危害巨大的疾病，围绕该疾病病原鉴定开展了研究工作。组织病理学研究发现，患病个体脾脏血红细胞大量死亡、堆积，造成细胞间隙增大，淋巴细胞细胞核出现空泡化变性；患病个体肾小管壁结缔组织发生溶解性溃烂或坏死，肾小球收缩，形成明显腔隙，肾间质组织崩解和坏死。研究建立了半滑舌鳎动物实验模型，回感实验结果显示，接毒组半滑舌鳎累计死亡率为80%，死亡个体表现典型脾肾坏死症状，电镜观察接毒个体的脾脏和肾脏中有大量形态、大小一致的病毒粒子，并通过超速离心获得病毒颗粒，确定半滑舌鳎脾肾坏死病毒（TSSKNV）是引起半滑舌鳎脾肾坏死症的病原。利用VIDISCA技术测序TSSKNV全基因组序列，得到477,787个有效读长，病毒相关读长269个。进一步数据比对与分析，拼接获得3283bp的片段，包含一个3150bp的完整开放阅读框，编码含有1049个氨基酸的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP），该序列与Hubei unio douglasiae virus 1的RdRP相似度最高，为41.70%。构建系统发育树，TSSKNV是一个与诺达病毒有一定相似度，但具有独特核酸序列特征的新的病毒。根据基因组数据，筛选设计引物，构建阳性对照质粒，建立了基于探针法qPCR的TSSKNV检测方法。该检测方法灵敏度约为20copies/μl。使用该qPCR检测方法，在患病个体脾脏、肾脏等组织中均检出信号，确定TSSKNV在宿主体内分布。建立了实验室规模的抑制疾病爆发的模型。研究还阐明了半滑舌鳎肾脏的细胞与组织结构，构建了半滑舌鳎肾脏细胞系。研究成果对于针对性制定半滑舌鳎疾病预防控制策略、恢复半滑舌鳎养殖业提供了理论和技术支持，具有十分重要的现实意义。