十字花科黑腐病菌与致病相关的一个小RNA的作用机理研究

Although the regulatory role of small RNA (sRNA) in the pathogenesis of human and animal bacterial pathogens has been studied in some detail, little is known about the role of sRNA in the pathogenesis of plant bacterial pathogens. Thus far, no sRNA has been assigned a definitive role in the virulence of the crucifer black rot pathogen Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc), a model bacterium for studying microbe-plant interactions. To understand the role of sRNA in Xcc virulence, in recent years we have been carrying out identification and functional analysis of sRNA in Xcc. We found that over-expression of the small RNA sRNAXcc-24 resulted in reduced virulence of Xcc but no effect on its growth in rich and minimal media, indicating that the sRNA plays an important regulatory role in the pathogenesis of Xcc. To clarify the molecular mechanisms by which sRNAXcc-24 regulates the pathogenesis of Xcc, in this project, we plan to (1) identify all genes and virulence genes that are regulated by sRNAXcc-24; (2) identify the direct targets of sRNAXcc-24, and the binding site as well as binding sequence of sRNAXcc-24; (3) determine the affects of sRNAXcc-24 binding on the expression of its target genes.

尽管人们对小RNA在人和动物病原细菌致病过程中的调控作用已有一些了解，但对小RNA在植物病原细菌致病过程中的作用还知之甚少。到目前为止，在十字花科黑腐病菌（Xcc）-一个研究微生物与植物相互作用的模式菌中还没有小RNA参与致病的报道。为了阐明小RNA在Xcc致病中的作用，近年来，我们在Xcc中开展了小RNA鉴定和功能研究工作。我们发现，过量表达小RNA sRNAXCC-24导至Xcc致病力显著下降但不影响其在基本和丰富培养基中生长，说明该小RNA在致病中起重要的调控作用。在本申请项目我们将（1）鉴定Xcc中所有受sRNAXcc-24调控的基因并确定其中的致病基因，（2）鉴定sRNAXcc-24的直接调控靶标以及它在靶标mRNA上的结合位点和结合靶序列，（3）弄清sRNAXcc-24的结合对靶标基因表达的影响，以达到阐明sRNAXCC24调控致病的分子机理的目的。

十字花科黑腐病菌（简称Xcc），也叫蔬菜黑腐病菌，是引起包括主要蔬菜如白菜、萝卜、甘蓝等和重要的油料作物油菜在内的所有十字花科植物黑腐病的病原菌，该菌是研究微生物与寄主相互作用分子机理的模式菌。另外，此菌还是工业原料黄原胶的生产菌。核开关（Riboswitch）是一段位于mRNA的5’非翻译区（5’UTR）中具有调控该mRNA自身表达功能的RNA序列，它广泛存在于细菌中，在细菌的硫代谢、辅酶合成、氨基酸合成等基础代谢，以及病原细菌的致病过程中发挥非常重要的调控作用。尽管人们对核开关在许多细菌中的存在、功能和调控机制已有较深入的了解，但对它们在黄单胞菌（Xanthomonas）中的作用还一无所知。我们之前的研究结果显示，Xcc的一个小RNA，sRNAXcc-24，可能在致病及生理过程中发挥重要的调控作用。本项目采用遗传、生化和分子生物学手段对sRNAXcc-24调控基因表达的分子机制进行了深入研究，取得了以下原创性结果：（1）发现sRNAXcc-24是一个SAM-I核开关（命名为SAM-IXcc），它通过感受细胞中的腺苷甲硫氨酸（SAM）的量来调控met操纵子（met operon）的表达，在调控Xcc的甲硫氨酸合成中起关键作用。这是首次在黄单胞菌属中发现有调控功能的核开关。（2）发现SAM-IXcc主要使用翻译调控机制来调控基因表达，但同时也具有转录调控功能。之前发现的所有SAM-I型核开关均只有转录调控功能。SAM-IXcc是至今发现的第一个能使用翻译调控机制的SAM-I型核开关。（3）发现SAM-IXcc的表达平台（expression platform）具有Sensor功能，它能与空载的起始甲硫氨酸tRNA（tRNAfMet）特异结合。核开关由适体结构域（aptamer domain）和表达平台（expression platform）两部分组成。适体结构域与特定的代谢分子结合后会导致表达平台的结构改变，从而影响基因表达。之前发现的所有核开关的表达平台只负责变构，SAM-IXcc的表达平台是至今发现的第一个具有Sensor功能的表达平台，SAM-IXcc也是至今发现的第一个可以感受两种不同的代谢（信号）分子的核开关。总之，本项目发现了一种新型核开关，该发现不但拓展了人们对核开关的认识，而且对Xcc的防控药物开发也具有重要的参考价值。