十字花科黑腐病菌小RNA分子伴侣蛋白Hfq的作用机理研究

The small RNA chaperone protein Hfq acts as a post-transcriptional regulator and plays important roles in various cellular processes such as growth, central metabolism, cell motility, stress tolerance and pathogenesis. The role of Hfq in the pathogenesis of bacterial pathogens has been paid the most attentions, and much is known about the molecular basis for the virulence functions of Hfq in human/animal bacterial pathogens. However, little is known about the role of Hfq in the pathogenesis of bacterial phytopathogen. Our previous studies showed that deletion of the hfq in Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) resulted in reduced productions of virulence factors, reduced virulence, increased sensitivity to stress and impaired cellular motility and the altered phenotypes can be restored by hfq in trans, demonstrating that Hfq plays an important in these physiological processes. To understand the molecular basis behind these phenotypes, in this study, we plan to: (1) identify Hfq-regulated genes (including the virulence genes that are regulated by Hfq) genome-widely; (2) identify Hfq-bound RNAs (small RNAs and mRNAs) and Hfq-binding sequence; (3) determine the effect of Hfq binding on the target RNA, by using the transcriptomics, proteomics, as well as other molecular biology methods and techniques.

小RNA分子伴侣蛋白Hfq作为转录后调控因子在细菌的生长、中心代谢、细胞运动、环境胁迫响应以及致病等生理过程中发挥重要的作用，其中Hfq在致病中的作用是人们关注的热点。目前，尽管人们对Hfq在人和动物病原细菌致病过程中的作用有了较深入的了解，但对其在植物病原细菌致病过程中的作用却知之甚少。我们之前发现，十字花科黑腐病菌(Xcc)的hfq基因缺失导致该菌的致病因子产量降低、致病力下降、对NaCl的耐受力下降以及运动能力的丧失。这些变化的表型能被hfq基因互补，证明Hfq在致病以及对环境的适应等方面有重要作用。在本项目中，我们拟采用转录组学和蛋白组学等方法：（1）鉴定Xcc中所有受Hfq调控的基因并明确他们的功能，（2）鉴定与Hfq结合的RNA并鉴定Hfq在这些靶标RNA上的结合位点和序列，（3）弄清Hfq的结合对靶标RNA的影响；以达到阐明Hfq在Xcc中发挥作用的分子机理的目的。

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）能够感染包括重要的蔬菜如大白菜、萝卜、甘蓝和花椰菜，重要的油料作物油菜，以及模式植物拟南芥在内的几乎所有十字花科植物引起黑腐病。黑腐病爆发时会导致相关作物严重减产和品质下降，造成严重的经济损失，严重威胁我国蔬菜和油料生产安全。另外，Xcc还是工业原料黄原胶的生产菌。由于在农业和工业上的重要性，Xcc的分子生物学研究，特别是致病调控机理越来越受到人们重视。Xcc已成为研究微生物与寄主相互作用分子机理的最重要的模式菌之一。. 在本项目实施之前，我们的研究发现，在十字花科黑腐病菌8004菌株（Xcc8004）中，RNA分子伴侣Hfq蛋白在致病、致病因子产生、对环境胁迫的适应、以及细胞运动等细胞生理过程中发挥重要的正向调控作用，但发挥这些功能的通路以及作用机制未知。本项目的目的是，采用现代分子生物学方法和技术，阐明Hfq发挥功能的通路和机制。为此，本项目主要开展了（1）Hfq调控元（Hfq regulon）的鉴定；（2）受Hfq调控的基因的生物学功能鉴定；以及（3）依赖Hfq的小RNA（Hfq-dependant small RNA）的鉴定及功能研究。取得了以下的主要学术成果：.1).确定了Hfq调控元，证明Xcc8004的Hfq是一个全局调控蛋白。.2).首次发现受Hfq负调控的fimT、pilV、pilY和pilE1基因具有抑制Xcc8004细胞涌动能力的功能。.3).在Xcc8004中进行了系统的依赖Hfq的小RNA的鉴定。首次发现大量小RNA不依赖Hfq的现象。这个发现更新了人们对细菌小RNA独立发挥功能能力的认识。.4).发现小RNA sRX048具有增强Xcc8004细胞涌动能力的功能。sRX048是首个发现的具有增强涌动能力的小RNA。.5).揭示了Hfq正向调控Xcc8004细胞涌动能力的通路。. 总之，本项目完满完成了预定的任务，达到了预定的目标，拓展了人们对Hfq的功能以及细菌运动调控机理的认识，对Xcc的防控药物开发也具有重要的参考价值。