阿维菌素生物合成途径全局调控因子的精确改造与功能分析

由于复杂的代谢调控机制，如何快速高效的提高阿维菌素生物合成仍然是一项难题。申请人在前期对于高低产菌株的比较转录组学中发现，在高产菌株中转录水平明显改变的基因中，接近五分之一的基因（包括阿维菌素生物合成途径中的正向调控基因aveR）可能受到全局转录调控因子σHrdB的调控，提示我们对σHrdB的研究有助于进一步揭示阿维菌素合成生物途径的调控机制。本项目拟以现有的阿维菌素工业化菌株为基础，通过体外定向进化的方法构建σHrdB编码基因hrdB的突变库，进而构建突变菌库，利用前期建立的高通量筛选方法从中筛选能使阿维菌素产量进一步提高的突变菌株；对于获得的突变菌株与出发菌株，分析 hrdB 基因序列的差异并验证hrdB对关键基因的转录调控作用，进而探讨 hrdB 基因对于阿维菌素生物合成途径的影响，为进一步提高阿维菌素产量提供理论依据，并为阐明阿维菌素生物合成代谢调控奠定基础。

本项目组在前期对于阿维菌素高低产菌株的比较转录组学中发现，在高产菌株中转录水平明显改变的基因中，接近五分之一的基因（包括阿维菌素生物合成途径中的正向调控基因aveR）可能受到全局转录调控因子σHrdB的调控，提示我们对σHrdB 的研究有助于进一步揭示阿维菌素合成生物途径的调控机制，因此本项目以现有的阿维菌素工业化菌株3-115为基础，通过体外定向进化的方法构建σHrdB编码基因hrdB的突变库，进而构建突变菌库，利用前期建立的高通量筛选方法从中筛选出使阿维菌素产量进一步提高的突变菌株A56；并对A56中hrdB基因进行了初步的序列特征分析。同时，本项目对通过ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）技术解析hrdB在阿维链霉菌全基因组范围内的DNA结合位点进行了初步的探索，以此为基础有望在未来的后续工作中从全基因组水平定量hrdB蛋白与DNA的相互作用，从而全面解析基因调控机制。.此外，在研究过程中，我们始终密切关注国内外研究的最新的发展情况。2011年初发表于Applied and Environmental Microbiology上的一篇文章（Crabbe et al., 2011. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Appl Environ Microbiol, 77, 1221-1230）中指出，微重力环境可以诱导P. aeruginosa的全局转录和蛋白组响应，通过比较转录组和比较蛋白组的研究，发现在微重力条件下变化显著的基因大部分受到与毒力相关的RNA结合蛋白Hfq的调控，并由此初步阐述了Hfq的调控机制。在前期实验中本项目组同样发现微重力环境能提高阿维菌素生产菌株中阿维菌素的产量，因此推测对微重力环境中阿维菌素生产菌的生理响应进行深入研究有可能从另一方面帮助我们发现新的全局转录调控因子及其调控机制，为此我们对基金的研究内容进行了相应的调整。本项目发表了2篇SCI论文，获得1项省（自治区）级科技进步奖，出色地完成了预期的任务和指标。