利用亲和光交联和纳米微粒检测microRNA靶基因的研究

Specific microRNA regulates expression of a specifc group of target genes. Identification and validation of miRNA direct targets is crucial for understanding its cellular function. Combing techniques in nucleic acids chemistry, polymer chemistry and molecular biology, we propose a highly efficient PCR-free, IP-free method for rapid identification of miRNA targets. A photo reactive miRNA probe bearing an alkyne group is transfected to cells. Upon UV exposure, the RISC activated probe is crosslinked to its target mRNA in 3'UTR region to give miRNA-mRNA complex, which is subsequently conjugated to a azide & biotin containing polyacrylic acid in vitro through "click" reaction. The resulting biotin-labelled targets can be detected by using ultrabright silica nanopaticles. Establishment of this novel method will provide new insights into the development of highly efficient chip-based techniques for rapid identification of miRNA targets.

检测及确证miRNA靶基因对了解其参与的各种转录后调控作用具有重要的意义。申请人首次结合亲和纯化和RT-qPCR分析方法检测并验证了miRNA-29a在小鼠细胞内的部分靶基因。本课题拟利用亲和光交联和无PCR（PCR-free）、无免疫沉淀（IP-free）的超灵敏荧光分析法，快速检测miRNA在细胞内的直接靶基因。利用具备紫外光交联反应和"点击"反应双重反应性的miRNA探针转染细胞，通过紫外光处理，使miRNA探针在细胞内与靶mRNA共价交联，进而在细胞外通过 "点击"反应在miRNA-靶mRNA交联体上嫁接经过biotin修饰的高分子，在带有oligo DNA探针的玻璃表面进行分子杂交，最后用经过streptavidin修饰的超亮荧光硅纳米微粒显色，荧光检测仪读取荧光强度。本课题将为采用微阵列等方法在全基因组范围快速简便地检测miRNA靶基因提供新的思路和依据。

miRNA具有各种重要的生物学功能，确定miRNA的靶基因对研究RNA干扰的生物学意义，以及其潜在的临床应用具有重要意义。现有的miRNA靶基因确定方法，存在操作过程长、实验步骤繁琐、实验成本高等缺点。本项目的研究内容包括了新型核酸探针的设计合成、光交联反应条件的摸索、化学改性的miRNA的生物学活性的检测、miRNA靶基因确定方法的最终确立等。项目执行后我们首先在建立具有生物学活性的miRNA探针的高效制备方法方面得到很好的进展。本项目提供了一种化学修饰miRNA的方法，通过这种修饰方法可以制备保留生物学活性的miRNA衍生物，此衍生物可以作为探针寻找miRNA的靶基因，也有可能作为RNA类反义寡核苷酸类（antisense oligonucleotide, ASO）药物。本项目进而在建立基于探针的miRNA靶基因确定方法得到成功；此方法的优点在于，它所确定的miRNA靶基因，通过其他常规方法无法确定，并且简单、快速、准确，可以一次确定特定miRNA的复数靶基因。.我们在非小细胞型肺癌细胞株A549细胞上，验证了本项目确立的miRNA靶基因确定方法。我们采用具有重要生物学活性的两种微小RNA，即miRNA29a、miRNA34a，分别制备了探针；此类探针在对应的miRNA的种子序列区（seed sequence）共价连接了具有紫外光反应性的官能团（即psoralen），根据具体miRNA的具体序列也可以在3’末端连接生物素（biotin）。化学改性后的miRNA在转染到细胞后很好的保留了原有的生物学活性。通过初选，miRNA29a探针检测到了5个可能的靶基因，miRNA34a探针检测到了3个潜在的靶基因。通过进一步的验证，包括潜在基因的非编码区的克隆、双荧光分析，以及原细胞（A549细胞）内转染和western blot等试验，我们准确确认了miRNA29a的两个靶基因、miRNA34a的一个靶基因。.miRNA通过抑制靶基因，参与各种生命活动的调控过程，包括肿瘤的发生、免疫、发育、干细胞再生及分化。因此，研究miRNA具有重要的意义，确定miRNA的靶基因是了解miRNA功能至关重要。本项目建立的miRNA探针的检测和确定方法，对进一步设计和开发反义核酸的研究方法和手段提供重要的依据和线索，同时，在核酸生物学研究领域具有很好的应用前景。