利用DNA运载体及纳米孔传感检测技术研究肺癌循环MicroRNA表达谱

Lung cancer is the most common malignant tumor in China. Due to the lack of techniques for tumor early diagnostic, lung cancer was always found too late, and the 5 years’ survival rata is only 15%．In recent years，circulating microRNA (miRNA) from plasma is used as a new type of noninvasive biomarker for tumor early diagnostic and monitoring the response to treatment. However, the content of circulating miRNA in plasma is very low, the types of which are plenty, and the difference among them is little. There is no standard miRNA profiling for the early diagnostic and monitoring the response to treatment of lung cancer. Recently, due to the advantages of fast, high accuracy and label-free, nanopore single molecule sensing technique has been widely used for characterizing nucleotides, proteins and the interactions between protein and DNA. Our previous work enables us to characterize configurations of DNA and miRNA. On the basis of this, in this project we propose a detection technique using DNA carrier translocation through nanopore to scan the binding map of microRNA on DNA carrier, enabling the qualitative and quantitative analysis of specific miRNAs，followed with the analysis of miRNA profiling of clinic lung cancer. It opens a new possible way to characterize circulating miRNA from plasma, providing theoretical evidence for the diagnostic and treatment of malignant tumors.

肺癌是我国发病率最高恶性肿瘤。由于缺乏有效的早期诊断方法与技术，患者就诊多已为晚期，5年生存率低。近年来，外周血循环miRNA作为一种新型的无创生物标志物已开始用于肿瘤的早期诊断和疗效的监测，但由于其外周血中种类多、含量低、差异性小，目前尚无统一标准的miRNA表达谱用以临床肺癌的早期诊断及疗效的监测。最近，纳米孔单分子传感检测技术以其快速、高精度且无需标记的优势已被广泛应用于检测核酸、蛋白质以及蛋白质与DNA的相互作用。课题组前期已实现利用氮化硅纳米孔检测DNA分子构象及目的miRNA。因此，本课题提出利用自主设计编码的DNA运载体识别捕获miRNA，通过纳米孔传感检测技术对DNA运载体上miRNA结合位点进行扫描，以实现对miRNA的定性与定量分析，并试验于临床肺癌相关miRNA的表达分析。研究成果有望成为一种普适的循环miRNA表达谱检测技术，为恶性肿瘤的诊断与治疗提供理论依据。

本课题聚焦肺癌的高病发率及死亡率，旨在解决以microRNA（miRNA）作为肺癌诊治的无创生物标志物在外周血中种类多、含量低、差异性小，尚无统一标准的miRNA表达谱及检测方法用以临床肺癌的早期诊断及疗效监测的问题，提出设计组装了一种DNA运载体特异性结合多个目的miRNA，并通过纳米孔传感检测技术读取miRNA结合信息，从而实现快速、低成本、灵敏的miRNA检测的方法，以期望建立一种行之有效的精确、廉价、快速、高通量的可临床大规模使用的肺癌microRNA表达谱检测技术，用以提高早期诊断率、预测转移和指导用药。. 课题组首先利用生物信息学分析确定了肺癌相关的miRNA种类及其序列，设计并构建了可以特异性结合多个目的miRNA的DNA运载体，搭建了一套基于纳米孔传感检测的技术平台，优化了20nm的氮化硅自支撑薄膜结构，完成了5-10nm纳米孔的可重复制备，编写了一套DNA运载体通过纳米孔离子电流信号提取与分析软件，提出了引入成环结构、单体链霉亲和素（SAvPhire）、DNA复合臂三种方法放大sub-level信号的方法，最终成功实现了基于纳米孔检测的DNA运载体结合miRNA的定性与定量分析，该方法特异性可鉴别1个SNP，灵敏度达1pmol。. 本课题研究表明纳米孔传感检测技术结合DNA运载体可以实现快速、精准的miRNA特异性检测，进一步优化转化，有望开发成为一种临床适用的microRNAs检测技术，为肺癌乃至其他肿瘤患者的临床诊治、指导用药、治疗效果评价等方面提供参考。同时，该方法进一步推广，在抗原、抗体、基因片段、重金属离子等其他单分子、高灵敏的检测上有着巨大的潜在应用价值。