CD4+/CXCR5+/CCR6+循环Tfh细胞在ACPA产生中的作用及调控机制

Anti-cyclic citrullinated protein/peptide antibodies (ACPA) appear years before the onset of rheumatoid arhritis（RA）.It is thought that ACPA play a critical role in etiopathogenesis of RA and may also trigger RA and generate an immune response,but their creation and regulation in RA remains unclear. T follicular help (Tfh) cells are located in the light zone of Germinal center(GC) in secondary lymph nodules and have been suggested to be critical for production of antibody and constructing of germinal centres(GC) in secondary lymphoid tissue.Recently some subtype of the blood CD4+/CXCR5+ T cells, known as "circulating" Tfh, have been shown to efficiently induce na?ve B cells to produce immunoglobulin. They play an important role in autoimmune diseases.Our laboratory show for the first time that the frequency of Th17 like (CD4+/CXCR5+/CCR6+)subsets of CD4+/CXCR5+ T cells is increased in RA patients and positively correlated with autoantibodies in the blood. It indicated that Th17 subsets T cells could differentiate into Tfh and provide cognate help to antigen-specific B cells, leading to B cell proliferation and differentiation into antibody-producing plasma cells. This project is intended to be applied FACS method sorting "cycling" Tfh subtypes using siRNA gene silencing and target molecules blocking technology to verify the role and regulatory mechanism of cycling Tfh cell to original B cells and ACPA-specific B cell activation in vitro and the SCID model,Protein Chip Technology to analyze the downstream signaling pathways,in order to provide a new biological targets for early treatment of RA.

抗环瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）在类风湿关节炎(RA)关节损伤中起到重要的"启动"作用，但其产生机制及调控因素至今不清。 滤泡辅助T细胞（Tfh）定位于生发中心，在抗体产生过程中发挥"决定性"作用。最新研究证实外周血CD4+/CXCR5+ T细胞某些亚型具有Tfh细胞潜质称为"循环"Tfh，在抗体产生中发挥重要作用。我们前期的研究首次发现RA患者外周血Th17样亚型（CD4+/CXCR5+/CCR6+）Tfh细胞显著升高、具有Tfh细胞特性且和ACPA滴度呈正相关，推测其具有生物学活性并参与ACPA生成。 本项目拟应用FACS法分选"循环"Tfh各亚型，体外培养验证其对ACPA产生的影响，采用siRNA基因沉默及靶分子阻断技术在体外培养及SCID模型上验证其对原始B细胞及ACPA特异性B细胞活化作用及其调控因素，探索其在ACPA产生中作用及分子机制，旨在为RA的早期治疗提供新的生物学靶点。

抗环瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）在类风湿关节炎(RA)关节损伤中起到重要的“启动”作用，但其产生机制及调控因素至今不清。ACPA可早于RA关节症状出现10-15年，ACPA阳性人群更易发展为类风湿关节炎，提示ACPA是RA使动因素，如果能特异性抑制ACPA的产生有望早期治疗和预防RA的发生。.目前针对ACPA产生的部位和调控因素尚不清楚，近年来滤泡辅助T细胞（Tfh）在B细胞分化及高亲和力抗体产生中发挥重要的调控因素。我课题组对RA关节滑膜和滑液进行了深入研究，我们的结果表明RA膝关节滑膜中有异位“生发中心样结构”形成，组化结果表明滑膜中具有树突细胞、Tfh及B细胞具有异位生发中心基本结构，并产生激活诱导脱氨酶（AID）和增值诱导配体（APRIL），RA滑液中Tfh细胞比例显著高于骨关节炎，其中TH17样Tfh细胞数量和比例均显著升高且和外周血ACPA、MCV滴度呈正相关，滑液中TH17样循环Tfh活化后高表达ICOS、CD40L、PD-1，具有Tfh生物学特征提示ACPA可能产生于关节滑膜局部并受TH17样Tfh细胞调控。.为进一步研究Tfh细胞在ACPA产生中的作用及调控机制，我们分析了RA患者外周血Tfh各亚型及滤泡调节T细胞（Tfr），首次证实RA患者外周血Tfh及Tfr比例均升高，但Tfr功能性转录分子blimp-1下降，提示RA患者体内存在Tfh及Tfr失衡。 而针对Tfh亚型分析证实RA患者外周血存在四种亚型（TH1样、TH2样、TH17样亚型、CCR6+/CXCR3+双阳性），仅Th17样亚型T细胞数量显著升高且和抗CCP抗体（ACPA）滴度呈正相关，而和ESR、CRP无明显相关。在此基础上我们应用流式细胞仪分选RA患者外周血TH1样、TH2样、TH17样及CCR6+/CXCR3+双阳性细胞亚群，仅TH17样亚群及双阳性THD样Tfh在CD21刺激下表达共刺激分子ICOS、PD-1、CD147及转录分子Bcl-6并分泌功能性细胞因子IL-21。体外实验证明Th17样及THD亚群可刺激初始B细胞活化并产生ACPA，阻断IL-21可显著抑制ACPA的产生，阻断CD40和ICOS可不同程度抑制ACPA产生，阻断信号通路: mTORC1 and mTORC2 可显著抑制Tfh细胞分化及ACPA产生。研究结果表明TH17样Tfh细胞在ACPA产生中发挥重要作用，