智能响应型纳米囊介导的针对双免疫检查点的肿瘤分子靶向免疫基因治疗

Relieving immune tolerance via activation of the immune system, which kills tumor cells, is a promising tumor immunotherapy method. We have developed a redox responsive PDLLA-S-S-PEG nanocapsule previously. In this project, we are aiming to engineer an anti-cancer delivery system based on the PDLLA-S-S-PEG nanocapsule by conjugating the CTLA-4 aptamer to its surface while encapsulating a PD-1siRNA within its hydrophilic cavity. The CTLA-4 aptamer will subsequently facilitate CTLA-4 binding, tumor targeting and inhibit CTLA-4 activity, whilst the PD-1siRNA could ideally block the PD-1 pathway after cytoplasm release of the siRNA and interrupt the PD-1 mRNA synthesis. Thus, this nanocapsule-based delivery system could combine the both anti-CTLA-4 and PD-1 anti-tumor therapies by targeting both checkpoints on the same T cells, and activate the the cytotoxic effect of T cells against tumor cells.

肿瘤治疗方法繁多，其中通过解除肿瘤免疫耐受、激活机体自身免疫系统清除肿瘤细胞是一个极具潜力的治疗手段。大量研究均报道了联合应用针对免疫检查点CTLA-4和PD-1的抗体治疗多种类型的肿瘤疗效显著。本课题组在前期研究中设计合成了具有氧化还原刺激响应性的聚乳酸-S-S-聚乙二醇两亲性嵌段聚合物，并以此为自组装基元制备得到了具有疏水性囊壁和亲水性囊腔的智能响应型纳米囊。本项目提出构建携带CTLA-4apt和PD-1siRNA的智能响应型纳米囊，既可通过纳米囊表面的CTLA-4apt实现对纳米囊的靶向递送和产生类似CTLA-4抗体治疗的作用，又可通过包载PD-1siRNA，利用纳米囊的智能响应性实现siRNA胞浆递送，在mRNA水平上发挥干扰PD-1合成的作用，以此达到在同一个靶细胞上同时抑制两个免疫检查点的目的，实现叠加和协同效应，以最大限度的解除肿瘤免疫抑制、激活机体对肿瘤的识别和杀伤作用。

应用免疫检查点抑制剂解除肿瘤免疫耐受，激活机体自身的免疫系统清除肿瘤细胞，是一个极其重要的肿瘤免疫治疗手段。其中抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体等已成功应用于临床，在黑色素瘤、肾细胞癌、小细胞肺癌治疗中均显示出可喜的疗效。近两年有大量研究报道联合应用这两个检查点抑制剂在多种类型的肿瘤治疗中均取得了良好的疗效。但由于抗体需要量较多，且对产品纯度要求极高，而目前的生物工程生产比较困难，因此，产品生产成本及价格均非常昂贵，因此，我们选择CTLA-4核酸适配体（CTLA-4 Apt）来代替抗CTLA-4抗体，CTLA-4核酸适配体有着特异性强和亲和力高、合成简单快速、免疫原性低、稳定性好、价格低廉等优点。RNA干扰（RNA interference，RNAi）被认为是一种非常具有发展潜力的基因治疗手段，本项目应用PD-1 siRNA来干扰免疫抑制分子PD-1的表达，从而发挥对免疫耐受的阻断作用。将两者共负载于通过分子自组装制备成的PLGA-S-S-PEG纳米球上，利用CTLA-4核酸适配体对免疫抑制分子CTLA-4蛋白的靶向作用，更好地将PD-1 siRNA递送进免疫细胞，在同一个靶细胞上同时抑制两个免疫检查点，实现疗效的协同作用。此外，比较将两者负载在不同纳米球上较小程度作用于同一个靶细胞与负载在一个纳米球上更大程度作用于同一靶细胞所引起的免疫反应情况。本项目通过研究两亲性分子PLGA-S-S-PEG的合成及自组装纳米球的制备以及条件优化，纳米颗粒介导的淋巴细胞核苷酸摄取和增殖实验，及体内实验抗肿瘤免疫疗效，结果发现将PD-1 siRNA和CTLA-4 Apt负载在不同纳米球上联合使用，其作用效果优于两者单独使用，但劣于两者负载在同一个纳米球，提示两者联合作用具有免疫协同作用，尤其将两者共同负载于同一纳米载体以作用于同一个细胞产生的协同作用更大。因此，在CTLA-4 Apt靶向作用下，通过纳米递送体系的介导可实现PD-1 siRNA和CTLA-4 Apt两者的免疫协同作用，为提供一种疗效显著给药可控的靶向性的基因免疫治疗手段奠定了实验基础。