CaMKⅡ信号转导通路及相关受体在大鼠心肌肥厚心律失常中的变化和稳心颗粒的干预研究

大量临床和实验研究证实稳心颗粒具有抗心肌肥厚心律失常的确切疗效。左室肥厚具有发生潜在性、致死性心律失常的电生理机制。最新研究证明，钙（Ca）-钙调蛋白(CaM)-钙调蛋白激酶(CaMKⅡ)信号转导通路是左室肥厚心律失常的新靶点和热点。.本研究拟通过建立腹主动脉缩窄8周大鼠心肌肥厚模型，采用分子生物学与膜片钳与激光共聚焦结合技术，从Ca－CaM－CaMKⅡ细胞信号转导通路研究稳心颗粒抗心肌肥厚心律失常的细胞分子机制, 为临床应用提供实验和理论基础。内容：1、通过RT-PCR技术、Western斑点印记技术，研究CaMKⅡ、兰尼丁、钙泵mRNA和蛋白的表达的变化。2、同时运用激光共聚焦显微镜和膜片钳相结合的技术检测稳心颗粒是否能够通过降低CaMKⅡ活性表达影响肥厚心肌细胞L型钙通道电流和胞内钙瞬变和减少早期后除极的发生率。进而从信号与物质、结构变化的内在关系揭示稳心颗粒抗心律失常的机制。

目的：研究稳心颗粒是否通过调控相关细胞信号转导通路中蛋白受体离子通道而降低心律失常的发生率。进而通过观察细胞膜电流变化与通道蛋白组成变化，从信号与物质、结构变化的内在关系揭示稳心颗粒抗心律失常的机制。方法：1、通过RT-PCR技术、Western斑点印记技术，分别在组织、细胞、基因、蛋白水平上研究中医药对不同时期心室肥厚性心律失常钙－钙调蛋白(CaM)－钙调蛋白激酶（CaMKⅡ）细胞信号转导通路相关蛋白受体，包括蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、兰尼丁(ryanodine)受体、钙泵(SERCA) mRNA和蛋白的表达的变化。同时运用激光共聚焦显微镜和膜片钳相结合的技术（此项技术是目前世界上研究膜钙通道和胞内钙离子的活动最先进的方法）检测稳心颗粒是否能够通过降低蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）活性表达进而影响肥而厚心肌细胞L型钙通道电流和胞内钙瞬变和早期后除级（EAD）心律失常的发生，而减少心律失常的发生。结果：模型组EF和FS明显低于假手术组，胺碘酮组和稳心颗粒组明显高于模型组，而EDV，ESV和LVDS低于模型组，表明稳心颗粒和胺碘酮组均能改善心衰大鼠的心功能；实验结果表明，稳心颗粒组能够显著降低CaMKII， p- CaMKII（Ser-286），PLB的表达，升高p-PLB（Thr-17）,RYR2和 FKBP12.6表达；稳心颗粒能明显抑制ISO诱导的钙瞬变，与CAMKII的抑制剂KN93有相似的作用；同时能抑制肌浆网内的钙离子的泄漏；稳心颗粒可以显著降低早后除极和晚后除极的发生率；稳心颗粒能显著减少体外实验中心衰大鼠发生心律失常的发生率；WXKL均明显呈剂量依赖性地缩短TAC组的APD20，APD50和APD90。浓度依赖性显著降低对照组的ICa-L。稳心颗粒能够降低肥厚心肌细胞ICa-L的表达，加速通道的失活减小钙通道电流，延迟ICa-L失活后恢复时间。结论：稳心颗粒能够明显改善心衰大鼠的心功能，改变CAMKII细胞信号转导通路蛋白的表达，而在细胞水平上，稳心颗粒可以纠正心肌细胞钙循环异常，抑制ISO引起的心肌细胞钙瞬变幅度的增高，与KN-93的抑制效果相近，减少肥厚心肌L钙电流的表达，由此可以进一步证实稳心颗粒在钙循环中的作用途径，可能是通过调控CAMKII通路蛋白而减少心律失常的发生。