氧信号转导调控微生物多糖热凝胶合成的机理

Various cellular physiological activities of the microbes are regulated by the oxygen signal transduction. In the previous research focused on the energy metabolism and curdlan biosynthesis in Agrobacterium sp., dissolved oxygen was found to influence the genes transcription relating to curdlan biosynthesis pathway, central metabolic pathways and electronic respiratory chain. Further research is needed to clarify how the oxygen signal regulates the biosynthesis of microbial polysaccharides..The bioinformatics analysis and transposon insertion mutagenesis will be employed to explore new regulatory proteins involving curdlan biosynthesis. Based on the construction of various regulatory proteins invalid mutant strains and high-throughput DNA microarray technology, the difference in functional gene transcription levels between the wild strain and mutant lines in the oxygen-rich, micro-aerobic and anaerobic conditions will be compared. Then the regulatory relationship between the oxygen signal transduction and curdlan biosynthesis would be deduced. By using gene complementary expression and construction of lacZ reporter vector carrying regulatory protein gene promoters, the activity of regulatory protein gene promoters and their transcriptional targeting will be investigated. The function of examined regulatory proteins and their relationship will be verified. Finally, the regulatory network relating to the oxygen signal transduction to curdlan biosynthesis would be constructed. The results will enrich our understanding of the bacterial signal transduction network and the regulatory mechanism of the microbial polysaccharide biosynthesis.

氧信号转导调控微生物细胞的一系列生命活动，在研究微生物多糖热凝胶生物合成的能量代谢过程中，发现溶氧在转录水平上调节热凝胶合成途径、中心代谢途径和电子呼吸链相关基因的表达，但氧信号如何调控微生物多糖的合成需进一步研究阐明。本申请将运用生物信息学分析和转座子插入突变等方法，探寻热凝胶合成代谢过程中新的调控蛋白；构建一系列调控蛋白无效突变菌株，利用高通量DNA 芯片检测技术，比较土壤杆菌野生品系与突变品系在富氧、微氧和无氧条件下的功能基因转录水平差异，推断氧信号转导与热凝胶合成之间的调控关系；通过基因互补表达实验和构建调控蛋白基因启动子lacZ 报告基因载体，考察调控蛋白基因启动子的活性及转录靶向性，验证调控蛋白的功能及其相互关系，最终架构起关联氧信号转导和热凝胶合成代谢的调控网络。本研究将丰富微生物信号转导网络体系，对深入认识微生物多糖代谢调控机理具有重要作用。

微生物多糖广泛应用于食品、医药、化工和采油等领域，热凝胶（curdlan）是第三个经美国FDA 批准为食品添加剂的微生物多糖，其分子结构为葡萄糖分子以β-1,3 糖苷键线性连接的聚合物。.. 分析了土壤杆菌在不同溶氧水平下生产热凝胶的发酵特性，发现溶氧不仅影响热凝胶的生产强度和产物浓度，而且影响热凝胶的分子量和微晶结构，后者是目前首次发现这一现象。.. 利用蛋白质组学技术研究了不同溶氧水平下土壤杆菌生长期和产胶期胞内总蛋白的表达差异，发现溶氧对土壤杆菌的代谢影响涉及多糖合成、脂肪酸合成、氨基酸合成、应激反应及氧化还原等。其中葡萄糖磷酸变位酶和乳清苷5-磷酸脱羧酶直接参与调控热凝胶合成，表明溶氧可显著影响与热凝胶合成途径相关蛋白的表达。.. 根据同源重组原理构建了土壤杆菌目的基因缺失菌株ΔexoR和ΔexoX。土壤杆菌ΔexoR和土壤杆菌ΔexoX菌株热凝胶合成能力和碳源转化率明显增强。采用荧光定量PCR (RT-qPCR)从转录水平对土壤杆菌ATCC 31749合成热凝胶进行了研究，表明土壤杆菌ATCC 31749由菌体生长期到产胶期，菌体的代谢能力可能降低。产胶期土壤杆菌ΔexoR和土壤杆菌ΔexoX菌株中exoA，exoF，exoP，exoQ四种热凝胶合成相关基因的转录水平均高于野生菌株，热凝胶合成相关基因转录水平增加有利于热凝胶生产效率的提高；这是提高热凝胶合成速率和产量的主要原因。.. 获得fnrN基因突变株(△fnrN)，基于RNA-seq，对产胶期土壤杆菌ATCC 31749野生菌和△fnrN差异表达基因进行分析。fnrN的突变使土壤杆菌合成热凝胶能力下降了22.0%，转录组分析发现在△fnrN中186个基因表达发生显著性变化，其中65%的基因表达上调。热凝胶合成的关键基因crdASC的表达受到不同程度的抑制，fnrN的突变使编码σ因子的ecfR和编码生物膜合成调节因子的sinR显著下调；△fnrN菌中与细胞色素有关基因cydAB、cy2、fixNOPQ的转录水平下调2-13倍。fnrN通过调控ecfR和sinR的表达调控热凝胶合成，通过调控fixNOPQ等基因的表达参与氧信号调控。