微生物胞外多糖生物合成调控基因的研究

链霉菌139产生一种新型胞外多糖依博素，对类风湿性关节炎具有显著抑制活性，已获国家发明专利，有望发展成为具有我国自主知识产权的新药。我们已确定其生物合成基因簇ste，生物信息学分析表明其中ste1与ste234为依博素生物合成的调控基因。.本课题拟确定ste1与ste234在依博素生物合成中的正负调控作用，探讨通过改变基因表达水平以提高依博素生成量；研究蛋白Ste1、Ste2对依博素生物合成基因簇中强启动子序列的调控作用，分析获得的基因缺失株中强启动子及其他基因的转录水平，深入了解其对依博素生物合成的调控机理；研究在不同碳源条件下，各调控基因转录水平的差异，并探讨上述基因和链霉菌139形态分化的相关性。.鉴于国内外尚无链霉菌来源胞外多糖生物合成基因研究的报道，且依博素有可能发展成为新型药物，故对其调控基因研究新颖性显著，具有较突出理论意义和潜在应用前景。

本研究利用基因阻断、基因回复、化合物分离提取，酶联免疫分析并结合凝胶阻滞、实时定量PCR以及扫描电镜等手段，分析了ste1与ste234基因在胞外多糖依博素产生菌链霉菌139中的生物学功能。本研究首次发现：（1）ste1在依博素生物合成中发挥负调控功能，基因失活后次级代谢物依博素产量显著提高；（2）进一步的机制分析显示ste1主要通过调控其特异的反应原件及依博素生物基因簇中的启动子发挥其调控功能，同时ste1还调控依博素生物合成基因簇中某些关键基因如引导糖基转移酶基因的转录进而调节次级代谢物依博素的生成；（3）ste1为一个新的光秃型基因 （bld基因），ste1基因突变株在不同碳源培养基上均无气生菌丝和孢子形成，分化明显滞后。（4）ste2基因失活后依博素产量提高，确定其调节依博素生物合成基因簇中启动子参与依博素生物合成的调控；（5）ste2是一个新的bld基因并参与了链霉菌139的形态分化，阻断ste2基因后，突变株孢子少，孢子链短且形态不规则，有孢子堆出现。（6） ste34基因失活后依博素产量显著降低，确定其与依博素生物合成相关。.同时本研究还获得了两株依博素高产菌株链霉菌139 D1和链霉菌139 D2，在提高胞外多糖依博素产量上具有极好的应用前景。