水稻草丁膦除草剂靶酶谷氨酰胺合成酶基因体外定向分子进化研究

目前草丁膦已在50多个国家注册，销售居全球除草剂前五名。抗草丁膦Bar基因已导入20多种作物，其中抗草丁膦的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜等已商业化。Bar基因专利为国外公司所垄断，影响了抗草丁膦作物在国内的商业化。因此，获得新的、具自主知识产权的草丁膦抗性基因具重大意义。鉴于草丁膦作用靶酶为参与氨基酸生物合成的谷氨酰胺合成酶（GS）。本项目创新性地设计从另一条途径获得草丁膦耐性基因，即通过水稻谷氨酰胺合成酶基因OsGS1-1的DNA shuffling突变和体外定向分子进化，最终筛选获得草丁膦耐性大大提高的OsGS1-1突变基因，完成OsGS1-1突变基因的原核表达、蛋白纯化、酶学性质和相关参数及蛋白质结构模型预测，初步阐明蛋白质结构和功能关系。同时通过拟南芥和水稻的遗传转化，对突变基因的耐草丁膦活性进行详尽研究和评价。本项目将对我国抗草丁膦除草剂作物的产业化进程起到积极的推动作用。

目前草丁膦已在50 多个国家注册，销售居全球除草剂前五名。抗草丁膦Bar 基因已导入20 多种作物，其中抗草丁膦的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜等已商业化,但是Bar 基因专利为国外公司所垄断，影响了抗草丁膦作物在国内的商业化。因此，获得新的、具自主知识产权的草丁膦抗性基因具重大意义。草丁膦的杀草原理是它能抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)，使氨在植物体内迅速积累，引起光合作用和光呼吸停止，叶绿体受损，从而导致杂草死亡。鉴于草丁膦作用靶酶为参与氨基酸生物合成的谷氨酰胺合成酶（GS），本项目创新性地通过对水稻谷氨酰胺合成酶基因OsGS1-1 的DNA shuffling 突变和体外定向分子进化，筛选获得耐草丁膦的谷氨酰胺合成酶基因。研究结果表明，通过对OsGS1-1基因5-7轮DNA shuffling 突变和循环筛选，最终筛选获得了4个草丁膦耐性大大提高的OsGS1-1 突变基因，获得的OsGS1-1突变基因构建到大肠杆菌表达载体，转化谷氨酰胺合成酶缺陷型菌株后，能够实现功能互补，在缺少谷氨酰胺且含有 200mM草丁磷的M9培养基上生长。对突变基因的氨基酸序列分析证实6个位点发生了突变，利用回复突变发现，其中2个位点变化R316C 和G245S对OsGS1-1草丁膦敏感性起关键作用。对OsGS1-1 突变基因的原核表达和蛋白纯化后，对野生型和突变OsGS1-1进行了酶学性质比较分析，草丁磷对突变酶的抑制常数比野生型GS分别提高了44; 19; 87.5和28倍。大幅度提高了突变酶对草丁磷的耐受性。以来源于玉米细胞质型谷氨酰胺合成酶（2d3c）的结构为模板，利用软件swiss-model分别对野生型和三个突变OSGS1（m2，m3，m4）进行同源建模，初步阐明蛋白质结构和功能关系，研究发现R316是ADP的结合位点，此位点突变为极性不带电荷的Cys后，会影响该活性区域的电荷分布，Cys还有可能与相邻的Cys形成二硫键，从而改变蛋白的局部构象。为了进一步确定OSGS1突变体的功能，本项目通过拟南芥和水稻的遗传转化，对突变基因的耐草丁膦活性进行详尽研究和评价。本项目将对我国抗草丁膦除草剂作物的产业化进程起到积极的推动作用。