新型维生素D类似物抑制肾脏远曲小管钠氯协同转运蛋白参与血压调节机制初探

Hypertension and chronic kidney disease severely impair human health. 1,25-(OH)2VitD3 not only regulate calcium and phosphorus metabolism, but also affect blood pressure and water salt balance by inhibiting renin-angiotensin II-aldosterone system (RAAS). However, there are no related study available now to prove 1,25-(OH)2VitD3 can modulate sodium and chloride reabsorption proteins in kidney. In this project, we will firstly apply vitamin D receptor (VDR) knockout mice and wild type mice and their distal convoluted tubule to investigate the effect and preliminary mechanism of 1,25-(OH)2VitD3 and a novel vitamin D analog—RO compound to renal distal convoluted tubule’s sodium chloride co-transporter (NCC) in vivo and in vitro (including NCC regulating signaling pathway: WNK4 SPAK/OSR1 or WNK4 SGK1). Besides, we will study the potential value of RO compound to regulate water salt balance and blood pressure without affecting calcium and phosphorus metabolism. Furthermore, the function of up-regulation and down-regulation of RAAS by different concentration salt diet on VDR modulating NCC will be investigated too. This project aims to provide theoretical evidence to the clinical application of novel vitamin D analogs, and indicate new thought to the development of anti-hypertension drug.

高血压和慢性肾脏病严重的危害着人类健康。活性维生素D不仅可以调节钙磷代谢，还可以通过抑制肾素-血管紧张素II-醛固酮系统间接影响血压和水盐代谢。但是目前尚无研究表明活性维生素D可以直接调节肾脏钠氯重吸收蛋白。本研究将首次应用维生素D受体基因敲除小鼠和野生型小鼠及其肾脏远曲小管上皮细胞作为研究对象，通过体内外实验探讨活性维生素D和新型维生素D类似物—RO化合物对肾脏远曲小管NCC蛋白的直接作用及具体机制（包括调节NCC的信号传导通路：WNK4 SPAK/OSR1或者WNK4 SGK1），并将进一步研究RO化合物作为不影响钙磷代谢的新型维生素D类似物在调节水盐平衡和血压方面的潜在价值，同时初步探讨不同浓度盐饮食诱导或抑制RAAS系统在VDR调节NCC过程中的作用。为临床应用新型维生素D类似物提供理论依据，并为降压药物的研发提供新思路。

本项目分为3部分。. 1.维生素D受体和活性维生素D3类似物对肾脏纤维化的影响。选用单侧输尿管梗阻模型，首先对VDR基因敲除（KO）小鼠、野生型和villin-hVDR转基因小鼠（hVDR-Tg）小鼠进行实验，结果显示KO小鼠血钙水平明显低于野生型和hVDR-Tg小鼠。KO组小鼠的肾脏纤维化程度最严重，而hVDR-Tg小鼠肾脏纤维化程度最轻。接着，我们选择野生型小鼠和hVDR-Tg小鼠分别腹腔注射赋形剂、帕立骨化醇和RO化合物，野生型小鼠和hVDR-Tg小鼠的赋形剂组血钙水平与RO化合物组无显著差异，而帕立骨化醇组小鼠的血钙水平显著高于赋形剂组和RO化合物组。帕立骨化醇和RO化合物能减轻野生型小鼠和hVDR-Tg小鼠UUO模型的肾脏纤维化程度。说明高表达VDR可以减轻肾脏纤维化程度，帕立骨化醇和RO化合物可以改善小鼠肾脏纤维化程度，而RO化合物在改善肾脏纤维化的同时不影响血钙水平。. 2.活性维生素D3对内皮细胞功能的影响。系统性红斑狼疮（SLE）患者血清活性维生素D3水平明显低于健康对照组。与健康对照组相比，SLE患者肱动脉血流介导的内皮依赖性舒张功能和血浆NO水平明显降低，SLE患者内皮祖细胞（EPC）数量及增殖能力、迁移能力明显下降。用不同浓度的活性维生素D3刺激后，EPC的数量、迁移和增殖能力均显著升高，EPC分泌的NO显著升高，提示活性维生素D3可能通过上调NO表达改善SLE患者的EPC功能。. 3. 钠氯协同转运蛋白功能研究。来自310个家庭的338名中国患者通过基因测序确诊为GS，这些患者共携带155种突变。共发现了6个高频率突变--T60M, T163M, D486N, R913Q, R928C 和 R959frameshift。预测的蛋白三维结构均发生了改变。体外功能实验，与野生型NCC比较，6种突变型NCC蛋白摄取同位素22Na+的能力存在不同程度的下降。体内功能实验方面，35位基因诊断的GS患者和20例健康受试者进行了氢氯噻嗪实验，20位健康受试者△FECl显著高于GS患者，而有无携带T60M或D486N突变的GS患者之间无显著差异。我们首次将中国GS患者SLC12A3基因的高频率突变、突变蛋白的三维结构预测、突变型NCC蛋白的体内外功能整合起来研究。