WNK3激酶对钠氯协同转运子的调节作用及机制研究

Water-sodium retention is one of the core aspects of the pathogenesis of hypertension. And the latest researches have shown that WNK (With No Lysine Kinase) and NCC(sodium chloride cotransporter) play an important role in the regulation of blood pressure and maintenance of electrolyte balance. Since WNK3, an important member of the WNK family, was proved to increase the activity of NCC in oocytes of Xenopuslaevis, we hypothesize a similar change in renal cells of mammal. The plan is as follows.① To observe the distribution of WNK3 and NCC in renal cells of mammal by immunofluorescence. ② To understand the interaction between WNK3 and NCC through drug interference with the synthesis of cell proteins and the lysosomal pathway by means of western blotting and cell surface biotin labelling,mainly focusing on the possible mechanisms that WNK3 works upon synthesis, degradation and endocytosis of NCC protein. ③ To find out the effect of WNK3 active region on NCC by the transfection of WNK3 from different pathotypes. By tracing the action mechanism of WNK3 upon NCC, we aim to elucidate etiopathogenesis of hypertension and throw fresh light on the exploitation of a new action target for hypertensive drugs.

水钠潴留为高血压发病机制的核心环节之一。研究表明WNK 激酶(With No Lysine Kinase)和肾脏钠氯转运子（NCC）对调节血压和维持电解质平衡起重要作用。已知WNK 激酶家族成员之一WNK3能促进爪蛙卵母细胞NCC 的活性，本项目拟①应用免疫荧光等途径探索WNK3和NCC在哺乳动物肾脏细胞内的分布；②通过药物干预细胞蛋白合成及溶酶体降解等途径，采用western-blot、细胞表面生物素标记等方法了解两者的相互作用，观察WNK3对NCC蛋白合成、降解、细胞内吞的影响机制；③将不同致病体的WNK3转入细胞，观察WNK3酶活性区域对NCC的作用。旨在通过探讨WNK3 激酶对NCC 的调控机制，为阐明高血压的部分发病机理及开发新的降压药作用靶点提供分子生物学依据。

水钠潴留为高血压发病机制的核心环节之一。研究表明WNK 激酶(With No Lysine Kinase)和肾脏钠氯转运子（NCC）对调节血压和维持电解质平衡起重要作用。因此，探索钠氯协同转运子作用机理及调控途径对指导临床合理用药及开发新的降压药具有积极的意义。. 已知WNK 激酶家族成员之一WNK3 能促进爪蛙卵母细胞NCC 的活性，本项目拟①应用免疫荧光等途径探索WNK3 和NCC 在哺乳动物肾脏细胞内的分布；②通过药物干预细胞蛋白合成及溶酶体降解等途径，采用western-blot、细胞表面生物素标记等方法了解两者的相互作用，观察WNK3 对NCC 蛋白合成、降解、细胞内吞的影响机制；③将不同片段的WNK3转入细胞，观察WNK3 酶活性区域对NCC 的作用。. 结果显示1）免疫共聚焦显微镜可以观察到WNK3主要分布在Cos-7的细胞浆，而NCC分布在细胞浆和细胞膜，转染WNK3后，NCC在胞浆和包膜的表达量显著增强。2）WNK3、NCC转染Cos-7细胞，免疫印迹结果显示：随着WNK3剂量的增加，NCC的表达水平显著提高。3）Cos-7细胞单独转染GFP-NCC或同时转染HA-WNK3，抗HA抗体可以使HA-WNK3免疫沉淀NCC，但未转染HA-WNK3或血清作为一抗却不能免疫沉淀NCC，提示WNK3和NCC可以直接相互作用。4）WNK3激酶增加NCC蛋白表达可能通过减少NCC溶酶体降解途径调控NCC，而与蛋白合成途径无显著相关。5）通过观察不同WNK3 片段对NCC表达量的影响。证实只有包含酶区域的WNK3 片段能够增加NCC的表达量。6）WNK3抑制p-ERK1/2蛋白的表达，且与WNK3呈剂量依赖关系，提示WNK3可能通过MAPK ERK1/2 途径调节NCC。. 通过探讨WNK3 激酶对NCC 的调控机制，为阐明高血压的部分发病机理及开发新的降压药作用靶点提供分子生物学依据。