真核核糖体组装因子Sda1的结构和功能研究

Ribosome biogenesis in eukaryotes is a highly complex and extremely sophisticated process involving assembly of ribosomal proteins and transcription, modification, folding and processing of ribosomal RNAs. This process is regulated by more than 200 assembly factors. Loss-of-function mutations of certain assembly factors in human lead to dyregulation of ribosome biogenesis and may result in several human diseases referred to as ribosomopathies. However, the structure and function of most assembly factors remain unknown. Therefore, understanding the mechanism of ribosome biogenesis in yeast will provide a framework to insight into how human ribosomes are synthesized and help us find an effective treatment for those human diseases. Based on our previously solved cryo-EM structures of Nog2-TAP pre-60S ribosomes, we will focus on the rotation of 5S RNP by affinity purification of nucleoplasmic pre-60S ribosomes from Saccharomyces cerevisiae using the epitope-tagged Sda1 protein as a bait. With the help of protein crystallography and single-particle cryo-EM, we can not only interpret how Sda1 protein functions in ribosome biogenesis and the molecular mechanism of 5S RNP maturation, but also reveal the dynamic assembly process of 60S subunits during the interaction with Sda1.

真核核糖体的组装是一个高度复杂且精密调控的过程，包括80种核糖体蛋白的正确合成与有序结合，以及4种rRNAs的正确转录、修饰、折叠与加工。此外，有超过200种组装因子参与调控，然而大部分的结构及功能还不明确。有研究表明人类中某些组装因子的突变会导致核糖体合成的失调进而引起一系列核糖体相关的人类疾病。真核核糖体的组装过程较为保守，酵母与人类核糖体的大部分组装因子具有较高同源性。对酵母核糖体组装过程的研究有助于我们了解人类核糖体的组装过程，进而为核糖体相关的人类疾病提供有效的治疗方案。因此本项目以酵母组装因子Sda1为目标蛋白，以5S RNP的旋转过程为主要研究对象，将蛋白晶体学与单颗粒冷冻电镜技术结合，旨在阐释Sda1蛋白在核糖体成熟过程中的具体分子作用机制，揭示5S RNP的旋转机制及Sda1与核糖体大亚基作用时期的核糖体组装过程，进而深入阐明酵母细胞核内较晚时期核糖体大亚基的组装过程。

核糖体是一种存在于所有细胞中的核酸蛋白复合物，负责蛋白质的翻译。真核核糖体的成熟是一个极为复杂并且高度动态的过程，包括 rRNAs 的转录、修饰、折叠与加工以及核糖体蛋白的合成与组装。同时存在 76 种不同的 snoRNAs 与超过200种组装因子参与核糖体组装全过程的调控。有研究表明人类中某些组装因子的突变会导致核糖体合成的失调并引起一系列核糖体相关的人类疾病。然而目前绝大部分组装因子的结构及作用机制还不明确。对酵母核糖体组装过程的研究有助于我们了解人类核糖体的组装过程，进而为核糖体相关的人类疾病提供有效的治疗方案。本项目计划通过解析Sda1高分辨结构、Sda1耗竭下TAP-Nog2样品中所含不成熟60S亚基结构以及TAP-Sda1样品中可能含有的不成熟60S亚基结构，详细了解Sda1在核糖体60S亚基成熟过程中的分子机制以及60S成熟过程中5S RNP的旋转与ITS2 RNA剪切之间的关系，进一步了解细胞核内较晚时期核糖体60S亚基的动态组装过程。我们初步解析了Sda1耗竭状态下Nog2-TAP的样品，发现有明显变化的两类中间状态，分别为class 1和class 2，这两类都缺少组装因子Arx1、Bud20、Cgr1、Nug1和Nog1的C端。相比于Class 2，Class 1是一个全新的状态，此时ITS2 RNA被完全切除，但是L1 stalk的位置与野生型Nog2-TAP的状态一与二都不一样。L1 stalk的顶端与H81直接接触，而其基座部分则完全翻转处于非自然的状态。因此我们认为Sda1的耗竭能有效阻碍5S RNP的旋转，不能有效阻碍ITS2 RNA的剪切。此外Sda1的结合与释放可能帮助L1 stalk的正确定位。这些研究为深入理解本项目中的组装因子Sda1在核糖体60S亚基成熟过程中的作用提供帮助。