eIF4E介导的帽依赖性mRNA翻译调控在糖尿病难愈创面中的作用及分子机制研究

Treatment of diabetic foot ulcer is still a severe clinical challenges,thus it has important significance to further understand the molecular mechanisms of diabetic chronic wounds and to explore novel strategies for management of diabetic chronic wounds. A great deal of proteins need to be synthesized in the process of tissue repair, so it is necessary that protein translation machinery is activated in the process.In addition,the formation of protein translation intiation factor complex (eIF4F) is a key step for the beginning of cap-dependent mRNA translation.However,our data from preliminary experments showed that formation of eIF4F significantly decrease in the fibroblasts treated by high glucose and in the wound tissue from diabetic rat.So,we hypothesize that cap-dependent mRNA translation dysfunction caused by eIF4F formation disoder plays a major role in the diabetic wounds.To explore the effect of cap-dependent mRNA translation dysfunction on diabetic chronic wounds and it's molecular mechanisms,this project plan to detect the expression ,interaction and function change of special molecules in the signal pathway which activate eIF4E and regulate formation of eIF4F through S35-methione incorporation assay,reporter gene assay,ploysome assay,IB,IP and pull-down assay etc. Finally,a better understanding of the molecular mechanisms of cap-dependent mRNA translation on diabetic wounds is expected to lead to novel targets and strategies for the long-term management of this disease.

糖尿病难愈创面的治疗仍是临床面临的难题，深入研究其发生机制并寻找新的治疗措施有着深远的意义。创面愈合需合成大量蛋白质，激活并启动蛋白质翻译机是愈合过程中的必然事件。蛋白质翻译起始因子复合物4F形成是帽依赖性mRNA翻译启动的关键环节，但我们前期研究发现，高糖处理的成纤维细胞及糖尿病大鼠创面组织4F形成调控紊乱，由此提出"4F形成紊乱致mRNA翻译障碍是糖尿病创面难愈的重要原因"。为探索帽依赖性mRNA翻译障碍在糖尿病创面难愈中的作用及分子机制，本项目拟通过S35-甲硫氨酸参入法、报告基因实验、多聚核糖体检测技术、IB、IP、Pull-down、基因过表达和沉默等技术，从成纤维细胞、糖尿病致伤大鼠和糖尿病足患者肉芽组织样本等层面，研究介导eIF4E活化并促进4F形成的各分子调控通路特征分子的表达、相互作用和功能变化，从帽依赖性mRNA翻译角度揭示糖尿病创面难愈的新机制，并初步探索促愈新措施。

糖尿病患者难愈创面的治疗仍是临床面临的巨大难题，深入研究其发生机制并寻找新的治疗措施具有重要的意义。蛋白质翻译激活是创面愈合过程中的必然事件，而 eIF4E介导的蛋白质翻译起始复合物eIF4F的形成是蛋白翻译调控的限速步骤，有研究发现AKT/mTOR信号通路是调控翻译起始复合物eIF4F形成的重要信号通路，我们推测糖尿病患者在创面愈合的过程中可能存在AKT/mTOR信号通路的异常并由此导致创面难愈。. 本研究首先构建糖尿病致伤大鼠动物模型。与正常大鼠相比，WB检测发现糖尿病致伤大鼠创面肉芽组织中，信号通路AKT/mTOR关键蛋白p-AKT，p-mTOR的表达量上升的更少、更晚。同时，AKT/mTOR信号通路下游P70S6K和4EBP1在两者之间的差异也是如此。这些结果表明AKT/mTOR信号通路在糖尿病大鼠创面愈合的过程中活化的有所减弱。此外，我们通过m7-GTP pull-down实验检测发现与正常肉芽组织相比，糖尿病肉芽组织中翻译起始复合物eIF4F形成更少。这些表明糖尿病大鼠在创面愈合的过程中确实存在蛋白质翻译起始障碍。生长因子在正常的愈合级联过程中起着巨大的作用。我们采用生长因子GM-CSF刺激糖尿病大鼠创面，发现创面愈合明显加快，在肉芽组织中出现更多的细胞和血管。此外，qRT-PCR显示刺激后VEGF,TGF-β1，bFGF等因子上调，免疫组化及WB等检测发现刺激后微血管标记CD31也显著上升，还有α-SMA和胶原的生成也明显增多。这些结果表明添加GM-CSF可通过促进血管生成、成纤维细胞增殖以及胶原的合成来促进糖尿病大鼠创面愈合。我们用生长因子GM-CSF刺激创面愈合过程中的主要效应细胞成纤维细胞，MTT检测发现其增殖加快，WB检测发现刺激后p-AKT, p-mTOR和下游P70S6K，4EBP1和EIF4E的表达显著上升,与生长增殖相关蛋白PCNA和cyclinD1也显著上调。而添加mTOR抑制剂雷帕霉素却会抑制上述效应。这些结果表明GM-CSF是通过活化Akt/m TOR信号通路来促进成纤维细胞增殖的。此外，在体动物实验也证明GM-CSF是通过活化Akt/m TOR信号通路来促进创面愈合的。总之，我们的研究发现Akt/m TOR信号通路活化异常是糖尿病导致的创面难愈的重要原因，通过药物干预这条信号通路对于临床治疗糖尿病创面难愈是一个有潜力策略。