副溶血性弧菌转录调控子OpaR的功能研究

OpaR是副溶血性弧菌密度感应系统的核心调控子，目前对其功能的认识还很肤浅。本研究系统分析野生株、ΔopaR突变株、回补株的体外生长特性、相关生化特征、动物毒力、生物膜形成、泳动能力、群集性爬动等表型的基础上，采用DNA芯片比较转录组分析技术，结合生物信息学预测，鉴定OpaR的调控元，证实OpaR是个整体调控子控制着众多细胞途径；进而运用定量RT-PCR和凝胶阻滞实验技术，鉴定OpaR直接调控的靶基因；汇总毒力、生物膜、鞭毛、荚膜多糖合成相关基因，并加上OpaR自身结构基因，采用LacZ融合报告基因技术、引物延伸实验技术、DNA酶I足迹实验技术，深入研究OpaR是否并如何直接调控相应基因的转录；最后，将表型和分子实验数据结合起来，认识OpaR是如何通过调控自身编码基因、荚膜多糖合成基因、某些关键毒力基因、鞭毛基因的转录，实现自我调控，同时控制着毒力、生物膜形成能力、运动性。

OpaR 和AphA是副溶血性弧菌密度感应（quorum sensing，QS）系统的两个核心调控子，目前对它们功能的认识还比较肤浅。本研究首先构建了OpaR/AphA及其同源蛋白的DNA结合基序，进而利用基序对副溶血性弧菌QS系统信号传递所需关键基因的启动区进行了预测，结果显示在opaR、aphA和qrr的启动子区均含有与基序相似的序列，表明这些基因可能是OpaR和AphA直接的靶基因；因此，在构建opaR 和aphA突变株和回补株的基础上，利用LacZ报告基因融合实验、引物延伸实验、DNA 酶I 足迹实验等分子生化实验，深入研究了OpaR和AphA对opaR、aphA和qrr的转录调控机制，从而证明了副溶血弧菌QS系统信号传导机制与其亲缘弧菌的类似，为后续研究打下坚实的理论基础；另外，本研究还利用一系列表型实验技术，系统分析了AphA对副溶血弧菌毒力表型、生物膜形成能力、泳动能力、群集性爬动能力等表型的调控，证明了AphA能促进副溶血弧菌毒力、生物膜形成和运动性，据此我们可以初步推测OpaR调控的表型效应；利用经典的分子生化实验技术，本研究还系统分析了OpaR对hcp1，以及OpaR和AphA对cpsQ-mpfABC位点的联合调控机制，从而为理解QS系统调控副溶血弧菌适应性和致病性机制提供一定的理论依据。