副溶血性弧菌AphB和ToxR在毒力调控通路上的作用

副溶血性弧菌是我国最重要的海产品相关性病原菌之一，经常引起食物中毒。自1996年起，一个新的克隆开始在亚洲沿海地区流行，并传到世界其他地方。副溶血性弧菌最重要的毒力因子是耐热性直接溶血素（TDH），对其表达调控机理的认识目前并不完全。本研究在首次发现Vc-AphB调控子能够增强霍乱弧菌中霍乱毒素（CT）的关键调控基因Vc-toxR的转录表达的基础上，探讨Vp-AphB 调控子是否对副溶血性弧菌的毒力以及TDH的编码基因具有调控作用，以及这种调控作用是否是通过Vp-toxR基因进行的。以此为突破点，研究受到Vp-AphB和Vp-ToxR影响的其他基因，描述Vp-AphB和Vp-ToxR调控子的调控通路，以及探讨ToxR样蛋白VtrA和VtrB的可能调控作用。研究结果将为深入了解副溶血性弧菌的毒力调控网络提供新的思路，为快速诊断及疫苗的研发提供新的靶点。

研究背景：.副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种革兰氏阴性嗜盐弧菌[1]，是我国重要的食源性致病菌之一，对其毒力因子开展特征研究，有利于加深我们对其的认识，是进行针对性防控工作的重要基础内容。目前，国际上对副溶血性弧菌主要毒力因子的研究主要集中在耐热性直接溶血素TDH、耐热直接相关溶血素TRH和III型分泌系统等，涉及的主要毒力调控子包括有ToxR、VtrA、VtrB等[2-5]。我们的前期研究发现，AphB在霍乱弧菌的毒力调控中发挥着重要的作用[6]。但是，关于副溶血性弧菌Vp-AphB对毒力相关基因的调控作用还未见研究报道。本项目研究拟通过对副溶血性弧菌Vp-AphB、Vp-ToxR、VtrA、VtrB等基因之间的调控关系研究，揭示Vp-AphB的相关调控功能。.主要研究方向和内容：.1. aphB和toxR基因的遗传背景分析及临床分离株的基因携带情况分析。.2. Vp-AphB对毒力调控作用的研究。.3. Vp-AphB和Vp-ToxR、VtrA、VtrB间的调控关系研究。.方法：.1. 利用自杀质粒同源重组技术构建相关基因缺失株。.2. 通过报告质粒pBBRlux，构建能够反映相关基因表达水平的一系列报告质粒，并构建表达质粒pBAD-aphB。.3. 将不同的报告质粒转入至野生株或相关缺失株中，检测LUX活性，从而评价基因的表达水平。.结果：.1. 副溶血性弧菌中Vp-AphB和Vp-ToxR与霍乱弧菌高度同源，且本研究使用的临床分离株全部携带这两个基因。.2. 成功构建相关基因缺失株、报告质粒及表达质粒。.3. 和野生株相比，toxR、vtrA、vtrB基因的缺失，并未对aphB基因的表达水平产生显著性影响；同时，aphB基因的缺失，并未导致toxR、vtrA、vtrB基因的表达水平产生显著性差异。.4. 在大肠杆菌中，AphB的过量表达不能够增强toxR的转录表达水平。.结论：.本项目研究发现，aphB基因在副溶血性弧菌中，并不像其在霍乱弧菌中发挥的重要作用，尽管二者遗传同源性很高。在副溶血性弧菌中，aphB基因并不具有直接影响副溶血性弧菌毒力表达的能力，对相关毒力基因toxR、vtrA、vtrB亦无调控作用，同时，toxR、vtrA、vtrB基因的缺失也未影响到aphB基因的表达。