苯丙烷途径相关酰基转移酶功能鉴定及其进化研究

苯丙烷途径作为植物三大次生代谢途径之一，不仅在植物的生长发育的各个阶段发挥重要作用，许多代谢产物也具有很强的生物活性。植物BAHD酰基转移酶家族的许多成员作为关键酶参与苯丙烷代谢途径。申请者从水稻和苔藓中克隆了2个参与苯丙烷途径的新型BAHD酰基转移酶基因（一个N-酰基转移酶和一个O-酰基转移酶），并获得了其中一个N-酰基转移酶的结晶。拟进一步从水稻中克隆参与木质素生物合成的BAHD酰基转移酶。在此基础上对上述酶进行体外酶学特性及体内生化/生理功能的鉴定，同时将通过蛋白质晶体的X-衍射及模拟解析获得蛋白质的三维结构。通过这些蛋白结构与功能的关系研究确定并验证决定N-/O-酰基转移酶功能转换及各酶底物特异性的关键结构域。另外，将通过上述研究揭示苔藓（无维管束）、水稻（单子叶）及拟南芥（双子叶）三种植物中苯丙烷途径（特别是木质素合成途径）BAHD酰基转移酶在进化过程中的演变。

在陆生植物的演化过程中，苯丙烷类化合物扮演着重要作用。小立碗藓在进化过程中处于植物从水生向陆生生境进化的过渡阶段，研究小立碗藓的苯丙烷代谢途径可使我们进一步了解苯丙烷类化合物的进化历程。参与苯丙烷代谢途径中的木质素合成的HCT在小立碗藓中并未报道。通过PCR获得PpHCT基因全长cDNA序列，原核表达后进行酶活力测定。HPLC-MS结果显示当以p-coumaroyl CoA为酰基供体时，PpHCT催化反应的酰基受体为quinate和shikimate；当以caffeoyl CoA，feruloyl CoA为酰基供体时，PpHCT催化反应的酰基受体只能是shikimate；PpHCT催化反应不能以sinapoyl CoA为酰基供体。通过PCR获得PpHCT上游1.9 kb的启动子片段和AtHCT上游1.5 kb的启动子片段克隆到带荧光素酶报告基因的载体pGW::Luciferase上。通过荧光素酶检测检测系统检测MYB与HCT之间的作用得知，AtMYB58和AtMYB63能促进HCT的表达，PpMYB58、PpMYB63能抑制HCT的表达。从结果可以推断PpMYB对HCT的抑制作用是小立碗藓中没有木质素合成的部分原因，同时提示MYB对HCT的调控作用从小立碗藓到拟南芥的进化过程中的变化。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，但是对于水稻中的苯丙烷途径及其酰基转移酶编码基因的研究相对于拟南芥等双子叶植物来说还很缺乏。我们建立起了有广泛针对性的代谢分析的步径MIM-EPI（多离子监测-增强产物离子）方法，建立了MS2T数据库。方法主要流程。利用该数据库，进一步发展了一种能够检测包括超过70种水稻苯丙烷产物的高通量代谢组学检测方法。我们发现包括黄酮及酰基化多胺在内的苯丙烷代谢产物在上述两个品种中存在显著差异，提示苯丙烷途径可能在干旱响应中发挥重要作用。在两个不同品种研究的基础上，我们选取了38个水稻品种分析不同代谢物的差异，并用主成分分析的方法可以明显的将籼稻粳稻分型，结果显示其中苯丙烷代谢物在主成分中占有很大比例（结果未列出），提示其可能在在水稻亚种分化中发挥作用。进一步利用MH63和ZS97构建的重组自交系群体对水稻苯丙烷代谢物进行QTL定位，获得了大量QTL位点。结合代谢物结构、基因注释等信息，确定了包括黄酮酰基转移酶在内的24个候选基因，并构建了水稻黄酮生物合成途径。