ING4基因表达的亚细胞定位影响胰腺癌增殖、侵袭的分子机制

胰腺癌是一类恶性程度很高的消化系统肿瘤，三年生存率不足５％，目前对其恶性生物学行为的分子机制还不甚清楚。抑癌基因ING4与人类恶性肿瘤的发生关系密切，目前研究发现其不同的亚细胞定位影响该基因的抑癌功能。申请者前期研究发现，胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中ING4表达以胞浆为主，提示抑癌基因ING4的异常胞浆表达可能具有促癌意义，与胰腺癌的发生发展关系密切。基于文献报道及前期工作基础，本课题拟构建含ING4全长及核定位区域的突变体，应用细胞转染、裸鼠成瘤等方法从组织学、细胞学以及动物模型三方面，研究ING4基因的不同亚细胞定位对胰腺癌增殖和侵袭的影响，并通过蛋白组学和质谱分析以及基因干扰等技术进一步探索可能存在的未知分子途径，为深入阐明胰腺癌的发病机制提供新的理论和实验依据。

目的: 胰腺癌是一类恶性程度很高的消化系统肿瘤，三年生存率不足５％，目前对其恶性生物学行为的分子机制还不甚清楚。抑癌基因ING4与人类恶性肿瘤的发生关系密切。前期研究发现ING4在胰腺癌中存在核、浆两种定位方式，而且在癌组织中多为异常胞浆表达。本研究旨在探索ING4的亚细胞定位对胰腺癌细胞生物学活性的影响及其形成的差异表达的蛋白谱，为阐明ING4在胰腺癌中的作用机制提供新的理论和实验依据。方法：利用组织芯片和免疫组化技术检测了ING4在胰腺癌组织中的表达情况；利用RT-PCR检测了ING4在胰腺癌细胞株中的表达情况，筛选模型细胞株；利用PCR法构建了针对NLS区域的点突变和缺失突变体；利用免疫荧光检测质粒转染后目的蛋白ING4的表达定位；利用CCK8法、划痕实验和克隆形成实验观察各转染组细胞增殖和侵袭能力的改变；利用裸鼠皮下成瘤试验观察各转染组细胞体内成瘤情况；利用双向电泳和质谱分析，检测各转染组细胞在蛋白组学上的改变，并通过免疫组化和Western blot方法在细胞和组织水平分别加以验证。结果：1、ING4在胰腺癌组织中的表达以胞浆定位为主；2、NLS区域的缺失突变体能有效地抑制ING4蛋白进入细胞核，不仅能逆转ING4的抑癌作用，而且还能促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力（体外和体内实验）；3、蛋白组学研究发现，NLS缺失突变体能引起胰腺癌细胞内蛋白表达谱的改变，并在细胞学和组织学水平得以验证。结论：ING4的胞浆突变体不仅能逆转ING4的抑癌作用，并具有促进细胞增殖的生物学作用。