结直肠癌的全免疫细胞的精准分型及作用机制的研究

The goal of tumor immunotherapy is to activate immune system to kill tumor targets. However, current immunotherapy strategy in colorectal cancer has limited success. One of reasons is that the whole picture of the interactions of colon cancer cells, immune cells and microbiota is still missing. Herein, we plan to use mass cytometry techniques to analyze whole immune cell subsets in tumor, paratumor tissues and peripheral blood and immune signatures in tumor cells (such as PD-L1/PD-L2). Moreover, we will investigate tumor specific microbiota by sequencing 16S rRNA and address the interactions of microbiota, tumor cells, and immune cells. This work will help us to understand roles of immune cells in tumor development and metastases, as well as interactions of immune cells, microbiota and tumor cells, which may shed light on the novel tumor immunotherapy strategies.

重新激活免疫系统杀伤肿瘤是肿瘤免疫治疗的主要手段。但是，目前结直肠癌的免疫治疗效果并不理想。其中的一个原因在于从整体上我们缺乏对肠道局部的肿瘤细胞、免疫系统及肠道菌群三者之间相互作用的认识。本项目拟用质谱流式细胞技术，观察结直肠癌的肿瘤、癌旁及外周血的所有免疫细胞亚群的精准分型以及肿瘤细胞的免疫学标志物（PD-L1/PD-L2等）特征；发现肿瘤特异性免疫细胞亚群及其功能；并用16S rRNA全基因测序分析结直肠癌病人肠道特异性菌群；研究肠道菌群对肿瘤细胞、免疫细胞的影响及相互作用机制。本项目的研究结果将会极大的促进我们对结直肠癌局部肿瘤细胞、免疫细胞及肠道菌群的相互作用及这三者在肿瘤的发展、转移过程中的功能的理解，为肿瘤免疫治疗提供新的研究方向。

结直肠癌在发生发展的过程中，肿瘤细胞、免疫细胞及肠道微生物三者相互影响，形成肠道肿瘤微环境。而其中三者相互作用的机制细节并不很清楚。我们利用质谱流式细胞技术、组织RNAseq及16S rRNA测序技术对结直肠癌肿瘤细胞、免疫细胞及肠道微生物进行了检测。.（1）肠道免疫细胞特征：.相比于癌旁及远端正常组织，肿瘤组织内富集CD39+CD4+T细胞，PD1+CD8+T细胞，Treg细胞，CD103+CD69+ TRM细胞，MDSC。.（2）组织表面黏膜及组织内细菌学特征：.α多样性及β多样性分析发现肿瘤组织与远端正常组织的细菌组成有显著性差异。肿瘤内富集的菌有脆弱拟杆菌，梭杆菌属及弯曲菌属。.（3）结肠癌组织RNAseq分析： .发现IL-17信号通路、Wnt信号通路等在肿瘤上调基因中富集。.（4）肠道菌群与肿瘤特征性基因的相互关系分析：.发现Bacteroides fragilis与IL-17信号通路的多个基因呈正相关。体外实验证明B. fragilis细菌刺激结肠癌细胞系及肿瘤类器官可上调CSF2基因的RNA水平及GM-CSF蛋白分泌。FISH免疫荧光结果显示结肠癌组织内B. fragilis与GM-CSF共定位，组织内GM-CSF的相对浓度与B. fragilis数量呈正相关。.（5）GM-CSF表达与肠道免疫细胞的相关性分析：.我们比较了免疫细胞亚群与CSF2基因及B. fragilis的相关性，发现它们与Treg及CD39+TRM细胞呈正相关。体外实验进一步发现GM-CSF可以影响Treg细胞的功能。.我们提出了B. fragilis刺激肿瘤细胞及上皮细胞分泌GM-CSF，并诱导、影响Treg细胞功能，从而影响肿瘤免疫抑制微环境。该发现为理解肠道菌群对肿瘤、免疫细胞的影响提供了新的思路。