BTLA/HVEM信号途径在结直肠癌逃逸T细胞免疫监视中的作用及机制

BTLA是最近发现的CD28家族共信号分子，HVEM/BTLA（HVEM→BTLA）信号途径对T、B细胞活化起负调节作用，但BTLA/ HVEM（BTLA→HVEM）信号途径及其与肿瘤发生、发展的关系未见报道。申请者发现结直肠癌、肺癌、乳腺癌患者外周血可溶性BTLA水平升高，结直肠癌和肺癌组织高表达BTLA，并发现可溶性BTLA-Ig可调节DC表面B7-1/ B7-2的表达。据此推测，BTLA/ HVEM信号途径可能与肿瘤免疫逃逸相关。本项目拟在以往研究基础上，开展如下研究：分离结直肠癌患者肿瘤细胞，体外研究BTLA+肿瘤细胞对肿瘤患者T细胞分化和功能的影响；建立SCID小鼠结直肠癌异种移植模型，研究BTLA对机体抗肿瘤免疫的影响；证实肿瘤细胞通过BTLA/ HVEM信号途径抑制T细胞抗瘤活性，并探讨其胞内信号转导机制。本项目有助于为将BTLA作为肿瘤免疫治疗的新靶提供实验依据。

克隆了小鼠和人的BTLA、HVEM及B7-H4基因，构建了相应的原核表达载体、真核表达载体及表达BTLA的慢病毒表达载体。制备了抗人BTLA、HVEM、B7-H4的多克隆抗体，建立了检测人BTLA、HVEM和B7-H4的ELISA方法，采用该方法检测发现肺癌、结直肠癌患者外周血BTLA水平升高，且与病情呈正相关；发现肝癌、肺癌、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎患者外周血可溶性HVEM水平升高；发现多种肿瘤患者外周血中B7-H4水平升高，并与病情、疗效、病理分型密切相关。采用免疫组化、Western blot、RT-PCR方法，对人肺癌、结直肠组织中BTLA的表达进行了检测，发现两种肿瘤组织中均高表达BTLA。人结直肠癌组织中高表达B7-H4，并与BTLA成正相关。这些研究结果提示BTLA、HVEM、B7-H4与肿瘤的发生关系密切，可能是一类新的肿瘤标志物。.将表达BTLA的慢病毒载体感染小鼠肠癌细胞株CT26，经流式细胞术多次分选建立了高表达小鼠BTLA的肠癌细胞株BTLA-CT26，分别采用CCK-8增殖检测，PI细胞周期检测，PI-AnneixV细胞凋亡检测及划痕实验对BTLA-CT26生物学特性进行分析，发现BTLA过表达对CT26生物学活性无显著影响。将BTLA-CT26与同系小鼠外周血单个核细胞进行单向混合细胞培养，流式细胞术检测发现BTLA-CT26细胞能明显促进CD3+CD8+T细胞增殖，而对CD3+CD4+T细胞增殖无明显变化。ELISA检测细胞共培养过程上清中IFN-γ分泌，发现在共培养后的第三天上清中IFN-γ分泌增高。.将表达B7-H4-Ig融合蛋白的真核表达载体输注ConA诱发的肝损伤小鼠模型，探讨B7-H4-Ig融合蛋白对免疫性肝损伤的治疗作用，结果发现B7-H4-Ig可抑制ConA导致的小鼠血清ALT和AST的升高，抑制肝细胞坏死甚至高剂量ConA导致的小鼠死亡，进一步ELISA法和RT-PCR法检测发现B7-H4-Ig可下调血清IL-2、IFN-γ和IL-4的表达，但上调IL-10的表达。提示B7-H4-Ig对ConA诱导的免疫性肝损伤具有保护作用，其机制可能是通过下调血清IL-2、IFN-γ和IL-4的表达，上调IL-10的表达。