家蝇抗真菌肽分子的克隆表达与生物信息学研究

生物先天性免疫分子抗菌肽具有分子小，抑菌能力强，对热、酸碱及蛋白酶稳定等特点，具备了开发高效、低毒、不易产生耐药性的新型抗生素的潜力，抗真菌肽的研究也成了近年来研究热点。家蝇由于生活在杂菌丛生的环境，具有极强的免疫防御能力。课题组研究发现家蝇三龄幼虫血淋巴中含有多个抗真菌肽组分，并测定了其中一个抗真菌肽N端30个氨基酸序列，精确分子量和等电点，生物信息对比研究表明是一新的抗真菌肽。本研究拟运用RT-PCR、3'/5'RACE、LA-PCR技术，色谱技术，原位分子杂交技术，通过对家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽基因克隆、融合体表达、核酸和多肽序列测定、多肽二级结构测定、抗菌作用比较、细胞毒性检测、表达组织定位等方面的研究，并利用网络生物信息与已知昆虫抗菌肽数据进行同源性分析比较，进一步阐明家蝇抗真菌肽的功能特征和生物学特性，为深入开展家蝇多肽免疫体系的研究，和筛选新型真菌抗生素提供科学依据。

1 研究背景：. 目前病原真菌的危害已日益被人们重视，从天然产物中筛选药物先导体，开发新的毒副作用小，疗效高，不易产生耐药的新型抗真菌药物已成为一个重要研究前沿。在本国家自然科学基金项目的资助下，开展了对家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽(MAF-1)全长基因的深入研究。.2 目的：家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1全长序列基因克隆，原核表达体系构建，家蝇体内表达差异，以及分子部分改造研究。.3 主要内容、重要结果及关键数据.3.1 MAF-1目的基因全长序列获得、克隆表达及生物信息学研究：根据MAF-1的N端30个氨基酸序列设计简并引物，克隆了537bp核苷酸构成的MAF-1全长cDNA序列，包含一个开放阅读框，起始密码子和终止密码子，GenBank数据库登录号为HM178948。MAF-1成熟肽的全长氨基酸序列由156个氨基酸残基组成，理论分子量为17184.2Da，等电点为5.37。N端存在一跨膜螺旋区域，具有信号肽，富含α螺旋，其功能结构域正好位于第3个α螺旋区，有2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N端酰基化位点。成功建立了MAF-1全长基因重组BL21/DE原核表达系统，表达产物具有抗白假丝酵母菌（Canidia albicans）活性。.3.2 MAF-1家蝇体内表达差异研究：采用实时荧光定量PCR技术对家蝇抗真菌肽MAF-1基因在家蝇生活史各期及家蝇三龄幼虫不同组织部中的表达差异研究表明，家蝇3龄幼虫经热诱导后12h，MAF-1基因表达水平最高，唾液腺和脂肪体中的MAF-1基因表达水平明显比体壁及肠道高。.3.3 家蝇抗真菌肽MAF-1的抗真菌机制：MAF-1主要对白假丝酵母真菌细胞壁造成破坏，同时对真菌细胞DNA造成损伤。.3.4 MAF-1分子的部分改造及抗真菌机制研究：根据MAF-1结构域，人工改造合成了26个氨基酸组成的具有抗真菌活性的抗菌肽MAF-1A。基本结构为阳离子α-螺旋。初步证明 MAF-1A可通过抑制白假丝酵母菌孢子萌发和芽管的形成，降低真菌对人口腔黏膜上皮细胞粘附能力，从而影响真菌的致病能力。.3.5 MAF-1具有抗肿瘤作用：MAF-1能够抑制SGC7901细胞的增殖，可以下调该细胞G2/ M期CyclinB1和CDK1蛋白表达水平。.4 科学意义：本研究所得资料，对进一步从事家蝇先天性免疫研究，以及开发临床用新型抗真菌药物具有重要价值。