基于转录组挖掘的家蝇新抗菌肽(MD-APMs-17)的功能及其抗真菌机制研究

The research about structure, function and antibacterial mechanism of natura antibacterial peptides , development of safe and effective peptide antibiotics to solve the microbial resistance, that have become a new focus of antibacterial peptide research. MD - AMPs - 17 is a highly expressed genes which mined from house transcriptome database. There has not functional annotation in the Genebank about the genes. It’s an unknown function genes. In previous studies, recombinant MD-AMPs-17 protein was successfully obtained by prokaryotic expression system. It showed antibacterial activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. The activity was strongest against Candida albicans. On this basis, this project intends to study the antifungal activity, stability and molecular structure of recombinant MD-AMPs-17, to explore the relationship between structure and function; The antifungal mechanism will be studied by molecular biology technology, circular dichroism spectra, laser confocal microscopy, electron microscope, flow cytometer, flow cytometry and spectral analysis, to observe the extracellular structure (cell wall, cell membrane) and intracellular nucleic acid damage, thalline adhesion, hyphal formation and biofilm formation. The antibacterial mechanism of the recombinant peptide against Candida albicans will be investigated at the cellular and molecular level. The purpose of this study is to provide theoretical basis and experimental basis for the development of new and highly effective antibacterial drugs.

基于天然抗菌肽结构及抗菌机制的研究，开发安全、有效的肽类抗生素药物，是解决微生物耐药性这一世界难题的科学前沿。MD-AMPs-17是课题组从微生物感染12h后构建的家蝇转录组数据库中挖掘到的高表达基因，其在Genebank上尚未有功能注释，是一未知功能基因。前期采用原核表达系统成功获得重组MD-AMPs-17蛋白，体外证实了对G+、G-及真菌均具有抗菌活性，抗白假丝酵母菌活性最强。本项目在此基础上，拟深入研究重组MD-AMPs-17蛋白的抗真菌活性、稳定性及分子结构，探讨其结构与功能的关系；采用分子生物学、圆二色谱、激光共聚焦显微镜、电镜、流式细胞仪及光谱分析等方法，通过观察其对真菌的胞外结构（细胞壁、细胞膜）、胞内核酸的损伤以及菌体黏附、菌丝态形成和被膜形成的干预作用及其分子机制，从细胞水平和分子水平深入探讨该重组蛋白对白假丝酵母菌的抗菌机制，为开发新型高效抗菌药物提供理论基础和实验依据。

基于天然抗菌肽功能结构及抗菌机制的研究，开发安全、有效的肽类抗生素药物，是解决微生物耐药性这一世界难题的科学前沿。本项目深入研究了拥有自主知识产权的新型抗菌肽AMP-17 的生物学活性，通过对白念珠菌胞外结构、胞内细胞器及主要毒力因子的影响等几个方面，从细胞水平及分子水平系统探讨AMP-17 的抗真菌机制。我们进一步优化了AMP-17的原核表达条件；抗真菌谱分析显示其对几种常见致病性酵母菌热带念珠菌、克柔念珠菌、白念珠菌、近平滑念珠菌及新生隐球菌均有较强抗菌活性,且对人体红细胞无溶血作用。抗真菌机制研究结果提示：①AMP-17可以通过破坏白念珠菌细胞壁，干扰细胞膜结构、改变真菌细胞膜通透性、增加胞内渗透压以及影响白念珠菌细胞壁、细胞膜合成相关基因的表达来发挥抗真菌活性。②AMP-17所造成的ROS积聚、线粒体膜电位的去极化以及细胞周期的改变共同促进了白念珠菌细胞的凋亡与坏死。③AMP-17可显著抑制白念珠菌芽生孢子和芽管的生成从而阻断其形成菌丝，进而抑制生物膜的形成，其主要通过影响白念珠菌黏附、菌丝和被膜合成相关基因的表达发挥抑制作用。④AMP-17可以破坏白念珠菌成熟的生物膜结构，杀灭被膜中部分真菌细胞，使菌丝发生明显的断裂；影响菌丝及被膜合成相关基因的表达发挥一定的清除被膜作用，最终达到降低白念珠菌致病性及耐药性的目的。本研究从不同角度检测了新型抗菌肽AMP-17的抗真菌活性，并从细胞水平和分子水平探讨了其抗真菌机制。研究结果为该抗菌肽的进一步应用研究奠定基础，为抗菌肽的研发提供理论和实验支持。