泛素连接酶E3和转录因子WRKY2在桃果实Priming抗病反应中的调控作用研究

Priming response has been recognized as a common feature of the defense response induced by various elicitors in harvested fruits, where the fruits can express a faster and stronger activation of specific disease resistance after they have been infected by a pathogen. However, the molecular basis of defense priming is poorly understood. In current study, with the typical climacteric fruit peaches as the test material, the regulatory effect and interactive mechanism of ubiquitin ligase E3 and transcription factors (TF) PpWRKY2 associated with the priming response induced by elicitors such as BTH, MeJA and BABA in harvested peaches will be investigated and served as the core research content. Beginning with the exploit of ubiquitin ligase E3 containing RING structure, the present study is going to analyze the biological activity of the functional ubiquitin ligase E3 and TF PpWRKY2 and to explore the regulatory effects on the network of priming defense in peaches. Afterwards, the possibility of TF PpWRKY2 as the target protein of the ubiquitin ligase E3 and interaction between them will be determined, which will finally lead to the construction of the regulatory network of the defense priming based on protein regulation and elucidate the molecular regulation mechanism of priming response. This study will lay the foundation for the commercial use of induced disease resistance in postharvest storage of fruits based on priming mechanism.

Priming是激发子诱导采后果实抗病性的一种普遍形式，其赋予果实在病原菌侵染时展现更强更快抗病反应的能力，但其分子调控机理还不清楚。本项目拟在前期研究的基础上，以采后桃果实为试材，以化学激发子（MeJA、BTH和BABA）诱导的桃果实Priming反应中泛素连接酶E3与转录因子PpWRKY2对抗病性的调控作用及其互作机制为核心研究内容，从挖掘桃果实功能性含RING结构泛素连接酶E3入手，分析功能性泛素连接酶E3和转录因子PpWRKY2的生物活性，研究泛素连接酶E3和转录因子PpWRKY2在桃果实Priming抗病网络中的调控作用，探索PpWRKY2转录因子作为泛素连接酶E3靶蛋白的可能性并解析两者之间的互作模式，以期从蛋白调控的角度阐明桃果实Priming抗病信号网络，揭示Priming抗病反应的分子调控机理，为基于Priming现象的诱导抗病技术在果实采后保鲜中的应用提供科学依据。

Priming是激发子诱导采后果实抗病性的一种普遍形式，其赋予果实在病原菌侵染时展现更强更快抗病反应的能力，但其分子调控机理还不清楚。本项目以MeJA、BTH和BABA为激发子，寻找并分析了桃果实priming反应中重要调控因子PpWRKYs和泛素连接酶E3的互作关系及其中信号传导路径，以明确两者在priming反应中的位点和调控作用。结果显示，PpWRKYs和泛素连接酶E3在Priming抗性网络中充当着重要的调控位点，在激发子处理时首先启动桃果实ROS的迸发并传递至PpWRKYs，促进PpWRKYs转录水平的提高，使果实处于敏化（primed state）状态；随后病原菌侵染时则启动泛素连接酶E3基因表达和蛋白积累，并对PpWRKYs进行转录后修饰，从而诱导果实防卫反应的强烈表达，抵御病原菌的进一步侵染。具体而言，在JA或SA途径中， PpHOS1转录的泛素连接酶E3是主要的上游调控单元，而PpWRKY45和PpWRKY70则是下游调控单元，这些蛋白均定位于细胞核内。经MeJA处理的桃果实在遭受病原菌侵染时，其PpWRKY45和PpWRKY70表达量显著提高，可直接结合下游PRs基因或LOX基因启动子或顺式元件（如W-box），启动PRs基因的表达，从而促进果实抗病性的提高，表明PpWRKY45和PpWRKY70在桃果实JA/SA介导的priming抗性中发挥着重要作用。同时，在桃果实展现BABA诱导的Priming抗性时，果实中PpWRKY22和PpHOS1基因的表达量显著上调，并表现了较强的互作从而诱导PpPR1（SA传导标记基因）和PpNPR基因的表达，这说明PpWRKY22转录子可经由SA信号启动PpHOS1泛素化修饰以促进果实priming抗性的形成。其他类型激发子（如BRs、BTH和热空气）的相关实验则也验证了上述结果，果实中WRKYs基因表达量与泛素连接酶基因表达量呈正相关关系，分子实验也证实WRKYs与泛素连接酶之间也存在明确的互作关系，而这些互作作用则进一步受到细胞还原势的调控，显示果实中WRKYs基因的功能性与果实细胞中泛素化和还原势修饰密切相关。这些结论对于厘清WRKYs和泛素连接酶在桃果实priming反应中的关键位点作用及其相互关联具有重要意义，同时对抗性激发子的开发使用也具有较强的现实意义。