AMPK羰基化修饰在动脉粥样硬化斑块进展中的作用及其分子机制研究

The role of oxidative stress-associated protein carbonylation in pathogenesis of atherosclerosis plaques remains to be clarified. In the present study, we hypothesize that (1) oxLDL or high fat diet-induced oxidative stress may induce carbonylation and subsequent inactivation of AMPK, the master mediator of vascular protection; (2) carbonylation of AMPK directly contributes to the development of atherosclerosis; and (3) genetic and/or pharmacological targeting on AMPK carbonylation may prevent the development of atherosclerosis plaques induced by oxidative stress. We will use a combination of molecular biology, biochemical, proteomics, and transgenic approaches, to clarify the mechanisms by which protein carbonylation promotes atherosclerosis both in vitro and in vivo. Moreover, we will first test whether reactive carbonyl scavengers may prevent AS plaques by protecting AMPK functions. Our data will provide new information on the molecular mechanisms of oxidative stress-induced atherosclerosis and may be of value in identification of novel pharmacological intervention strategies.

为了阐明氧化应激所引起的羰基化修饰在动脉粥样硬化斑块发生发展过程中的作用及其分子机制，本项目申请者提出以下科学假说：（1）oxLDL刺激和高脂喂养引起的氧化应激可导致保护性蛋白AMPK 的羰基化修饰，从而降低AMPK 的活性；（2）AMPK 发生羰基化修饰后，可促进血管内皮功能失调和AS斑块进展；（3）对蛋白羰基化修饰的关键部位进行点突变和使用羰基化清除剂可起到抑制AS斑块进展的作用。本课题拟运用分子生物学、生物化学、蛋白质组学、基因突变等实验方法，将体外与体内研究相结合，探讨羰基化修饰降低AMPK活性的分子机制，研究AMPK的羰基化修饰、修饰部位的点突变以及羰基化清除剂对冠心病AS斑块的影响。通过本研究，将指出AMPK的羰基化修饰在冠心病中的作用及其机制，为防治动脉粥样硬化斑块提供新的研究方向和治疗靶点。

为了阐明氧化应激所引起的羰基化修饰在动脉粥样硬化斑块发生发展过程中的作用及其分子机制，本课题组在试管实验中观察了4-HNE 与AMPK 的直接结合以及RCS 清除剂对这种结合的抑制作用；观察了4-HNE 等多种氧化剂对AMPK 的活性的抑制作用和RCS 清除剂对这种抑制作用的逆转；观察了4-HNE 作用于AMPK 蛋白的C174和C200半胱氨酸导致AMPK 的活性降低；在内皮细胞中研究了羰基化修饰对AMPK 生物学功能的影响：在细胞实验中用oxLDL 模拟AS 发病时内皮细胞所处的微环境，观察经oxLDL刺激后，细胞内4-HNE 的产量增加以及4-HNE 与AMPK的 直接结合以及AMPK 点突变和RCS 清除剂对这种结合的抑制作用；观察了OxLDL 对AMPK 的活性的抑制作用以及AMPK 点突变和RCS 清除剂这种抑制的逆转作用；观察了经oxLDL 刺激后，导致的内皮功能失调以及AMPK 点突变和RCS 清除剂抑制oxLDL 引起的内皮细胞炎症反应；在动物模型中研究了羰基化修饰对AMPK 生物学功能的影响：在高脂喂养的ApoE-/-小鼠模型中，观察了内源性4-HNE 与AMPK 的直接结合；在AMPK羰基化修饰位点的点突变小鼠中，观察了对AMPK 的结构和功能的影响。申请者从AMPK 羰基化修饰与冠心病AS 斑块的研究入手，揭示羰基化修饰抑制AMPK 活性的分子机制，首次阐明抑制AMPK 羰基化可抑制斑块进展，为AS斑块的研究提供了新的思路；本课题组构建了AMPK M/M等羰基化修饰位点突变的小鼠模型，探讨了AMPK修饰位点突变对AS斑块的影响；应用RCS清除剂，探讨了抑制AMPK羰基化对AS斑块的影响。位阐明冠心病AS斑块发生发展的关键机制提供了新的方法和动物模型；本课题将揭示冠心病AS斑块发生发展的新机制，发现早期预警冠心病的生物标记物，提出防治冠心病的新靶点和新途径。