DHPM胁迫下β-乳球蛋白的空间构象变化与过敏性的关系研究

牛乳过敏严重威胁人类健康，β-乳球蛋白被认为是主要的牛乳过敏原，其致敏性是由其线性表位和构象表位共同决定。本课题前期研究表明：动态高压微射流（DHPM）等手段可胁迫蛋白质的空间构象发生改变。但目前国内外的研究主要集中在其线性表位与过敏性的关系研究，对构象表位与过敏性的关系不清楚。本课题拟以β-乳球蛋白为对象，利用DHPM等手段胁迫其发生构象变化，通过间接竞争性ELISA方法分析不同构象β-乳球蛋白的过敏性。表征胁迫前后β-乳球蛋白的构象变化：利用扫描电镜、原子力显微镜等方法测定其微观形貌，SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析β-乳球蛋白的分子量和变性度，园二色谱、傅里叶红外光谱和激光拉曼光谱分析β-乳球蛋白二级结构的存在形式和比例，二维核磁共振分析蛋白三维结构的变化。探明β-乳球蛋白构象与过敏性间的关系。为β-乳球蛋白在加工中的脱敏方法研究提供理论依据，对保障乳制品的安全具有重要意义。

降低过敏性是β-乳球蛋白改性研究的重点之一。针对β-乳球蛋白改性过程中构象变化与过敏性的关系不清楚，研究深度不够的现状，本课题以动态高压微射流（DHPM）以及DHPM结合温度处理等物理手段对β-乳球蛋白进行改性，从空间构象的角度研究改性过程中β-乳球蛋白构象变化与过敏性间的关系。研究发现：DHPM低压改性（<80MPa）过程中，β-乳球蛋白的过敏性成上升趋势，DHPM高压改性(>80MPa)过程中，其过敏性显著下降；当与温度（70-90℃）结合处理后发现，90℃条件下β-乳球蛋白的过敏性随着DHPM压力处理的升高而增加， 160MPa高压处理下其过敏性随着温度的增加而逐渐升高。通过表征DHPM胁迫β-乳球蛋白构象变化发现：在DHPM压力从0.1增加至80MPa时，β-乳球蛋白去聚集现象伴随着分子轻微去折叠的发生。这些变化是通过粒径的降低、游离巯基含量和β-折叠含量的增加以及芳香族氨基酸的轻微暴露反应出来的，并导致过敏表位暴露，与β-乳球蛋白过敏性增加直接相关。随着处理压力高于80MPa，β-乳球蛋白通过巯基催化二硫键交互作用的方式形成更大的聚集体而发生再聚集现象。这一现象是通过粒径的增加、聚集体的形成、巯基含量和β-折叠含量的降低以及芳香族氨基酸残基的轻微变化反映的。这些聚集体和构象变化导致过敏表位被重新包埋，促使β-乳球蛋白过敏性降低。当DHPM与温度结合改性过程中，通过內源荧光性增强和二级结构变化等实验结果反映出β-乳球蛋白构象发生去折叠变化，导致过敏表位暴露或形成新的过敏表位，从而促使β-乳球蛋白过敏性显著上升。此外，在本项目的基础上，还开展了DHPM改性过程乳清蛋白功能性质与构象的关系，β-乳球蛋白是一种主要的乳清蛋白，研究结果发现DHPM胁迫乳清蛋白发生两种情况的聚集态变化：蛋白的去聚集和再聚集，这两种聚集态的变化导致了DHPM胁迫下乳清蛋白功能性的变化。项目研究，基本弄清了DHPM等物理手段胁迫β-乳球蛋白构象变化与过敏性的关系，为乳制品过敏性的改性提供研究基础。目前，已发表学术论文8篇，其中SCI收录4篇；培养博士1名，硕士2名。