多聚ADP核糖糖基水解酶抗基因毒剂的作用机理研究

蛋白质的多聚ADP核糖化修饰与磷酸化、泛素化等修饰作用一样具有重要的生理意义，但目前对植物中多聚ADP核糖化修饰的作用了解非常之少。我们从拟南芥中发现一个与之相关的多聚ADP核糖糖基水解酶 [poly(ADP ribose) glycohydrolase， 简称PARG] 突变体，在含有基因毒剂丝裂霉素和博莱霉素的平板上，表现出与野生型完全不一样的生长状态：其叶原基及根尖生长点处的细胞分裂受到严重影响，表现为真叶的生长发育受阻；同时根的生长也较野生型大大减慢。进一步研究发现在突变体的根及叶片中积累了大量的活性氧，细胞死亡增加。这些表型说明，PARG1基因可能为根尖及叶原基细胞的DNA损伤修复所必需。我们将采用进一步的生理及生化分析手段，阐明植物PARG1在耐受基因毒剂胁迫时的作用机理。本项目研究结果将为了解植物体内蛋白质的多聚ADP核糖化修饰的生理调控作用提供依据。

多聚ADP-核糖化[Poly(ADP-ribosyl)ation]是生物体内一种重要的翻译后修饰。其正反应由PARP[Poly(ADP-ribose) Polymerase]催化，它以NAD+为底物，将ADP-核糖基团转移到靶蛋白上，形成多聚ADP-核糖 [Poly(ADP-ribose),PAR]链；而逆反应则由多聚ADP-核糖糖基水解酶PARG[Poly(ADP-ribose) Glycohydrolase]催化，它水解PAR，使蛋白质去除ADP核糖化修饰。拟南芥基因组具有两个位置相邻的PARG基因，一致性为57%，但它们的功能及进化上的关系不明确。我们发现，相比于野生型，PARG1缺失突变体parg1-4对基因毒剂博莱霉素敏感性增加：突变体根长变短，真叶生长变慢，并且发生细胞死亡。parg1-4突变体内积累了大量的PAR，PARP抑制剂 3-AB能够抑制PAR的积累，并恢复突变体的表型。进一步分析发现，parg1-4突变体中与DNA修复有关的基因表达水平上调，表明parg1-4中DNA损伤可能比野生型中更为严重，彗星电泳的结果证实了这种推测。PARG2基因的突变体parg2-1在正常情况及基因毒剂的存在下均显示与野生型一致的表型，说明PARG2在维持基因组稳定性上不起主要作用；通过RNA干扰技术抑制PARG2在parg1-4植物的表达, 发现parg1-4PARG2RNAi植株显示出比parg1-4单突变对基因毒剂更敏感的表型，说明PARG2在抵御基因毒剂的信号途径中起辅助作用。进一步对PARG1和PARG2进行表达分析发现，PARG1和PARG2均受基因毒剂的诱导，组织特异性相似。亚细胞定位发现，PARG1主要存在于细胞核；而PARG2则同时存在于细胞质和细胞核中。重组PARG1和PARG2在体外都具有降解PAR的活性。另外，在parg1-4突变体中，通过western blot检测到了3个多聚ADP核糖化修饰的底物，大小分别为35kD, 40kD和120 kD左右，这些条带在PARP抑制剂处理之后均会减弱或消失，说明是ADP核糖化修饰的底物。综上所述，我们的结果表明，拟南芥多聚ADP-核糖糖基水解酶PARGs对于维持基因组完整性具有重要作用，这种作用主要由PARG1来执行，PARG2保留了部分与PARG1相似的功能，但存在位置上已发生分化。