siRNA沉默ATM基因对人胶质瘤干细胞放射敏感性的影响

放疗是神经胶质瘤的主要治疗手段之一，辐射抵抗是脑胶质瘤放疗疗效差和治疗失败的重要原因，肿瘤干细胞的发现和分离为胶质瘤的治疗提供了新的思路。本研究通过分离、培养人脑胶质瘤干细胞，直线加速器不同剂量单次照射后，采用"彗星"分析法检测辐射所致肿瘤细胞DNA单链、双链断裂，观测放射损伤及修复情况；通过克隆形成率绘制细胞存活曲线，观测SF2等指标变化；同时检测细胞周期变化和细胞凋亡情况，观测人脑胶质瘤干细胞的放射敏感性及其相关分子基础，为深入了解胶质瘤干细胞的放射敏感性提供实验依据。在此基础上，通过siRNA干扰技术沉默放射敏感相关的ATM基因表达，观察阻断ATM基因表达后胶质瘤干细胞的放射敏感性变化，探索以肿瘤干细胞为靶细胞的肿瘤治疗新途径。

胶质瘤的放疗抵抗是临床治疗的难题，需要联合其它治疗策略提高治疗效果。不同实验室已证实，胶质瘤细胞（GC）的放疗抵抗与肿瘤中ATM基因的高表达有关，故可采用抑制ATM基因的表达，以达到提高肿瘤的放疗敏感性。研究发现胶质瘤干细胞（GSC）与放疗抵抗相关，由此我们推测GSC中是否也存在ATM高表达表况，是否可通过沉默ATM基因以提高胶质瘤的放疗敏感性。 我们从以下几个方面进行研究：1、胶质瘤干细胞的诱导和鉴定； 2、比较GC和GSC放疗敏感性的差异；3、采用siRNA干扰策略沉默ATM基因，并进行干扰效的检测； 4、通过体内、体外实验检测siRNA-ATM后GSC放疗敏感性的变化。 我们采用无血清培养基成功诱导并培养GSC，并采用CD133、nestin荧光双标法、裸鼠成瘤实验对GSC进行鉴定。电离辐照后，发现GSC的细胞克隆形成率、存活曲线高于GC，GSC的凋亡比例、G2期细胞阻滞比例、慧星拖尾比例低于GC (p<0.05)。采用western blot检测ATM、P53、che2细胞周期检查点蛋白水平，发现GSC组的三者蛋白表达明显高于GC组。　通过siRNA法沉默ATM基因后，并分三组：干扰组(siRNA-ATM,A)、空载组(siRNA-HK,N)、空白组(control,C)，采用western blot和RTQ-PCR方法检测，发现干扰组的ATM基因和蛋白表达均比空载组、空白组明显降低；电离辐照后，通过放疗敏感性方法检测后发现，干扰组的克隆形成实验、存活曲线低于空载组、空白组，干扰组的细胞凋亡比例、G2期阻滞比例、慧星拖尾比例明显高于空载组、空白组(p<0.01)，干扰组的细胞增殖数量明显低于空载组、空白组(p<0.05或0.01)。 我们将转染了siRNA-ATM(干扰组)和siRNA-HK（空载组）的胶质瘤干细胞分别移植到裸鼠皮下，行放疗后4周处死裸鼠行病理检查，发现干扰组的肿瘤出血、坏死明显多于空载组。通过研究比较，我们发现GSC比GC更加放疗抵抗。采用基因干扰的策略将ATM基因表达沉默，通过体内外实验提高GSC的放疗敏感性，该研究为胶质瘤的放疗增敏研究提供了可靠的实验基础。