W06A7.4基因在MDHB延缓线虫衰老中的作用及其机制研究

Preliminary study of our research group confirmed that Methyl 3,4-dihydroxybenzoate (MDHB) obviously retarded aging in C.elegans with high expression of W06A7.4 gene ,the Homo sapiens orthologs of which is transmembrane protein 144 gene. At present, the function of W06A7.4 in C.elegans remains unknown. This study is to investigate whether W06A7.4 is a target gene of MDHB and whether MDHB displays antiaging effects through the overexpression of W06A7.4 gene. In this study, genomics methods, including CRISPR/Cas9, RNAi, gene transfection, site-directed mutagenesis and qPCR will be used to investigate whether MDHB retards aging in C.elegans by alterations in the expression of W06A7.4 gene and whether W06A7.4 is a potential longevity gene. This study is to elucidate the mechanism of the antiaging effects of MDHB in C.elegans at gene level, so as to provide reference basis for further development and utilization of MDHB. Since W06A7.4 is homological to Homo sapiens transmembrane protein 144 gene, it is of great significance to study the function of W06A7.4 gene，which will be conducive to the recognition and prevention of age-related disease, such as neurodegeneration disease.

本课题组前期研究证实，3,4-二羟基苯甲酸甲酯(MDHB)可明显延缓秀丽隐杆线虫衰老，同时伴有W06A7.4基因(与人类跨膜蛋白144基因同源)的高表达。本研究拟探讨W06A7.4基因是否为MDHB的靶基因？MDHB延缓线虫衰老是否通过W06A7.4基因的高表达来实现？目前，线虫W06A7.4基因的功能未知。本研究将采用基因组学的方法，包括基因敲除/敲入(CRISPR/Cas9法)、基因沉默(RNAi)、基因转染、定点突变、qPCR等，以探明MDHB是否通过改变W06A7.4基因表达发挥延缓线虫衰老的作用；W06A7.4基因是否为一潜在的长寿基因。本项目将在基因水平阐明MDHB延缓线虫衰老的机制，它将有助于MDHB进一步开发利用。同时，本项目还将着重阐明W06A7.4基因的重要功能意义，由于该基因与人类有同源基因，其重要功能的发现还将有助于对人类某些衰老性疾病如神经退行性疾病的认识和防治。

本课题组前期研究证实，3,4-二羟基苯甲酸甲酯(MDHB)可明显延缓秀丽隐杆线虫衰老，同时伴有W06A7.4基因(与人类跨膜蛋白TMEM144基因同源)的高表达。本研究拟探讨MDHB延缓线虫衰老是否通过W06A7.4基因的高表达来实现？本研究以野生型线虫为动物模型，进行寿命实验，同时进行脂褐素累积衰老相关指标检测，观察MDHB对线虫寿命及衰老相关指标的影响。用CRISPR-Cas9技术敲除W06A7.4基因，获得W06A7.4基因功能缺失线虫株，研究W06A7.4基因对寿命的影响，及其与MDHB抗衰老作用间的联系。此外，目前在人类，TMEM144的功能未知。我们发现TMEM144 基因表达量在细胞、人脑组织以及线虫呈现增龄性变化。那么TMEM144基因是否为一潜在的长寿基因? TMEM144抗机体衰老作用及其分子机制又是如何呢？我们通过在体外敲低及过表达TMEM144检测细胞衰老相关指标，证实了TMEM144为一个抗衰老相关蛋白。通过在线软件TargetScan及双荧光素酶报告基因实验证实了TMEM144基因3’UTR结合的miRNA是hsa-miR23a-5p。进一步探讨TMEM144调控细胞衰老的分子机制，发现TMEM144主要定位于线粒体上，并显著提高线粒体内膜电位及减少细胞内ROS的生成量。通过对细胞内线粒体能量代谢的检测，发现TMEM144能够显著提高线粒体ATP的生成量及线粒体的最大氧呼吸量，表明TMEM144通过提高细胞内氧化磷酸化水平，增强对外界的氧化应激能力，进而发挥抗衰老作用。因此，本研究具有重要意义，3，4-二羟基苯甲酸甲酯(MDHB)具有抗细胞衰老及延长秀丽隐杆线虫寿命的作用，为临床抗衰老及与衰老相关疾病治疗药物的研究提供新的思路及理论基础。同时，TMEM144基因有可能成为研究脑衰老、脑衰老相关疾病以及增龄性生理变化的重要靶点。