TLR4/PKCα/Occludin信号通路介导的血脑屏障破坏在深低温停循环脑损伤中的作用及其分子机制的实验研究

Cerebral injury result from DHCA is an important factor influencing patient's prognosis.TLR4 signaling pathway involved ischemic reperfusion injury,and Occludin is the main protein consisting of tight juction in BBB from BMEC,while PKCα is a downstream molecular of TLR4 as well as rerulator of Occludin expression.Our pre-experiment results have confirmed TLR4 pathway participating DHCA cerebral injury and decrese of Occludin.We hypothesize PKCα mediates TLR4 regulating expression of Occludin,further result in cerebral injury.Combining multiple technology,we try to elucidate the pathogenesis of cerebral injury from the view molecular mechnism concerned of PKCα mediating TLR4 affecting the expression of Occludin.The aim of this study is to exploring the novel endogenous target molecular and provide theory evidence to develop novel neuroproctection strategy.

深低温停循环（DHCA）术后脑损伤是影响患者预后的重要因素,其发病机制尚未阐明。TLR4信号通路参与缺血再灌注损伤，Occludin是构成血脑屏障（BBB）脑微血管内皮细胞（BMEC）的紧密连接蛋白，蛋白激酶α（PKCα）既是TLR4信号通路的下游分子，又是调控Occludin表达的主要蛋白。本项目组前期的研究已证实，TLR4调控的信号通路参与了DHCA脑损伤过程，观察到 Occludin表达下降，由此本项目组推测，PKCα介导了TLR4信号通路对Occludin的表达，引起BBB结构和功能破坏，最终导致脑损伤。本研究联合应用多种实验技术，通过大鼠DHCA模型和BMEC 氧-葡萄糖剥夺（OGD）模型分别进行体内和体外实验验证，试图从PKCα介导TLR4信号通路调控Occludin表达分子机制角度阐明DHCA脑损伤，为寻找新颖内源性保护调控靶向分子、开发新型DHCA神经保护策略提供理论依据。

深低温停循环（deep hypothermia circulatory arrest,DHCA）广泛应用于复杂型先天性心脏病、获得性主动脉弓疾病、毗邻脑干的肿瘤和颅后窝巨大交通性动脉瘤等疾病，其在术中提供脑保护及其它生命器官的保护作用方面发挥了巨大作用，但术中脑损伤引起的神经系统并发症目前仍然是心外科医生面临的严峻考验，这是导致呼吸机带机时间延长、延迟留滞ICU、延长住院天数、增加住院费用和致死致残的主要原因，已成为影响预后最重要的风险因素。由此可见，DHCA术后脑损伤问题日益突出，已是心脏外科、麻醉科、体外循环科和神经科等多学科研究的难点和焦点，已成为严重影响患者术后预后转归、生活质量、身心健康和家庭和谐稳定的社会问题，亟待迫切得到妥善解决，而对该问题的解决有赖于对DHCA脑损伤发病机制的深入研究。目前DHCA术后脑损伤尚无有效的主动防御手段，根本原因是DHCA脑损伤发病机制尚未阐明，因此，在该方面进行深入的研究是致力于提高DHCA术后疗效课题的主攻方向。本研究通过建立大鼠DHCA模型以及OGD模型分别进行体内和体外实验研究，采用荧光TUNEL、qRT-PCR、Western blot、细胞分离和培养、免疫细胞化学标记法、腺病毒重组载体的构建、细胞转染及干扰RNA(shRNA)沉默技术，试图阐述TLR4/PKCα/Occludin信号通路介导的血脑屏障破坏在深低温停循环脑损伤中的作用及其分子机制。通过本研究发现TLR4/NF-κB信号通路参与了OGD/R处理后BV2细胞的激活，并可能通过此途径参与DHCA脑损伤发病机制，进一步发现TLR4/PKCα/Occludin信号通路与BBB损伤紧密相关。本研究为阐明DHCA脑损伤的分子机制、寻找确立新颖的干预靶向分子和建立转化优良的脑保护策略提供了理论依据。