抗肿瘤药物卡莫氟与ASAH1基因突变的共性神经毒性机制

Spinal muscular atrophy associated with progressive myoclonic epilepsy is a rare autosomal recessive entity caused by mutations in ASAH1. The activity of acid ceramidase encoded by ASAH1 was about 32% of wildtype. Acid ceramidase plays an important role in sphingomyelin metabolism and cellular proliferation. Different from Farber disease, whose enzyme activity is totally absent, the SMA-PME patients develop symptoms only restricted to spinal-cord motor neuron and other areas of the central neuron system. The anti-tumoral drug Carmofur is a highly acid ceramidase inhibitor. Patients treated with Carmofur develop symptoms such as muscle trembling and quadriplegia, which are in accordance with lower motor neuron degeneration in SMA-PME. Compared to the cells co-cultured with Carmofur, ASAH1-targeted and siRNA-mediated silencing neuroblastoma transfected with mutant recombinant plasmid is used as cellular model. The changes in sphingomyelin metabolites and key enzymes involved are studied by LC-MS/MS, quantitive RT-PCR and enzyme activity assay etc. This primary research of similarity neurotoxicity mechanism of Carmofur and mutation in ASAH1 may validate the hypothesis that acid ceramidase also plays key role in the neurotoxicity of Carmofur.

罕见常染色体隐性遗传病脊髓性肌肉萎缩伴随进行性肌阵挛性癫痫（SMA-PME）是由ASAH1基因的突变引起的。ASAH1基因编码的酸性神经酰胺酶在细胞鞘磷脂代谢和细胞增殖中具有重要意义。而抗癌药物卡莫氟同样具有抑制酸性神经酰胺酶活性的作用，卡莫氟的神经副作用包括颤抖，四肢麻痹等与SMA-PME病患同样的低端运动神经系统失调表现。本研究将与卡莫氟共培养的神经细胞形态行为与在ASAH1基因沉默的成神经细胞瘤细胞中转染带有ASAH1突变的重组质粒后的细胞表型相对比，采用液相色谱-质谱联用、荧光定量PCR、荧光标记酶反应底物等方法，研究抗癌药物卡莫氟在神经细胞中对鞘磷脂代谢途径（代谢中间产物的定量，代谢关键酶的表达）的改变与ASAH1基因突变型致酸性神经酰胺酶活性部分缺失细胞中的代谢是否一致，从而验证酸性神经酰胺酶作为卡莫氟的神经毒性的作用靶点的假设，用以设计新一代神经毒性较小的抗癌药物。

本项目通过研究对比酶抑制剂（抗癌药物卡莫氟）与ASAH1基因沉默的神经细胞的形态活性和代谢途径等，拟发现其共性神经毒性作用机制。首先建立了母神经细胞瘤细胞SH-SY5Y与酶抑制剂卡莫氟共培养模型，通过绘制对照组、卡莫氟低浓度和卡莫氟高浓度共培养的细胞生长曲线，观察细胞形态，研究神经酰胺代谢途径中12种关键代谢酶的应激表达变化以及酸性神经酰胺酶蛋白质生物合成量变化。结果发现卡莫氟能够抑制神经细胞的生长，细胞失去贴壁特性呈悬浮状态，酸性神经酰胺酶的生物合成随着ASAH1基因表达的略微增高而增加。其次使用siRNA干扰技术将SH-SY5Y的ASAH1基因沉默，48小时后观察到成功阻断了神经酰胺酶的生物合成。细胞失去轴突和树突分支，多数细胞呈现黑色凋亡小体。ASAH1基因在干扰的最初24小时内出现显著性增高，但是48小时后已回落，而编码神经酰胺合成酶基因CERS的表达持续降低，减少底物神经酰胺的合成。对比发现两种研究模型均引起神经细胞的凋亡，细胞丧失神经细胞的轴突和树突呈球状，细胞失去贴壁生长特性，漂浮在培养基中。神经酰胺代谢通路中的主要代谢酶的表达情况对比发现，无论是酸性神经酰胺酶的生物合成阻断或者酶活性受到抑制以后，ASAH1基因的表达都有应激性的上调。同时编码鞘磷脂去酯化酶的基因SMPD1出现过量表达及激活，大量降解鞘磷脂（轴突树突的主要组成生物大分子），造成神经酰胺的累积引起细胞凋亡。因此鞘磷脂酶的激活极可能是引起神经细胞凋亡的主要共性机制。