星形胶质细胞与神经元反馈调节在全氟辛烷磺酸诱导神经发育毒性的作用机制研究

As a new member of POPs, PFOS is known to induce developmental neurotoxicity and cause widespread concern in terms of severity and persistency. However, the underlying molecular mechanism is yet to be understood. It has been reported that astrocyte-neuron interaction plays an important role in modulating learning, memory and neurobehavior, probably by mediating the neurotransmission related to the Ca2+ signaling involved in synaptic plasticity. Our preliminary study showed that PFOS can disturb Glu-Ca2+signaling in damaged nervous system suggesting the potential role of astrocyte-neuron interaction in PFOS mediated neurotoxicity. In the present study, we will utilize primary astrocyte-neuron co-culture model to explore the mechanism in relation to PFOS induced neurotoxicity. By using real-time RT-PCR, Western blot and flow cytometry, we intend to get in-depth insight into molecular and cellular mechanism underlying PFOS mediated neurotoxicity.

全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS)是一种新型持久性有机污染物，其神经发育毒性的持续性和严重性已引起国内外学者的广泛关注。PFOS神经发育毒性分子机制尚不清楚。星形胶质细胞和神经元之间存在反馈，能够通过神经递质调节钙离子信号通路，影响突触可塑性，参与学习记忆等神经行为和活动。本课题组前期研究发现，PFOS可通过影响神经元谷氨酸-钙离子信号通路，引起神经系统发育损伤，提示星形胶质细胞-神经元可能在PFOS神经发育毒性机制中具有重要作用。本课题拟采用分离培养的原代大鼠海马区星形胶质细胞和神经元的染毒模型及细胞交叉染毒共培养模型，利用实时荧光定量，Western blot以及流式细胞仪等技术，探讨PFOS对星形胶质细胞和神经元Ca2+及Ca2+信号、神经递质的影响及可能的分子机制，从而为充分认识PFOS毒性、预防PFOS神经发育毒性提供实验依据。

动物实验发现，全氟辛烷磺酸(PFOS)是一种神经发育毒性物质。流行病学调查发现，母体脐带血PFOS浓度与出生后2岁儿童大动作发育相关。本课题利用新生24h大鼠，分别构建神经元、星形胶质细胞及神经元-星形胶质细胞共培养体系，形成PFOS暴露模型，探讨PFOS神经毒性机制。利用光学相差显微镜发现星形胶质细胞形态学改变，MTT法发现星形胶质细胞存活率呈剂量依赖性降低，DCFH-DA探针发现ROS生成量升高，试剂盒检测CAT、SOD活性降低，试剂盒检测发现谷氨酸含量降低、谷氨酰胺含量升高、谷氨酰胺合成酶活性降低，real time RT-PCR检测发现星形胶质细胞膜表面谷氨酸转运蛋白GLT、GLAST基因表达显著降低，谷氨酸合成酶基因表达也呈现显著降低，星形胶质细胞膜谷氨酰胺转运蛋白SNAT3和ASCT2表达降低，星形胶质细胞内钙离子浓度显著升高。利用光学相差显微镜发现PFOS可使海马神经元形态学改变，MTT法发现PFOS可降低海马神经元存活率，DCFH-DA探针检测发现海马神经元ROS含量增高，试剂盒检测表明LDH活性呈现剂量-依赖升高，JC-1探针考察发现线粒体膜电位降低，Lyso-track red探针检测发现神经元溶酶体与自噬体融合的数量升高，real time RT-PCR检测发现海马神经元自噬基因Atg 5，Atg 12表达升高，western blot 检测发现海马神经元caspase-3蛋白表达升高，对Beclin 1表达无显著影响，Hochest/PI双染检测发现细胞出现凋亡与坏死。利用神经元-星形胶质细胞共培养体系进行检测，结果发现星形胶质细胞能够显著减轻PFOS对神经元存活率、神经突生长影响。本项目结果揭示了星形胶质细胞在PFOS神经毒性作用中的重要地位，考虑到文献表明PFOS能够诱导神经退行性疾病发生的重要蛋白升高，有必要进一步利用神经元-星形胶质细胞共培养体系和基因干扰技术对PFOS神经毒性的细胞机制及分子靶点进行探讨，为预防PFOS可能引起的神经退行性疾病提供实验依据。