一种P450脂肪酸脱羧酶的酶学、酶工程及组合生物合成研究

Renewable, carbon neutral, and hence environment-friendly bio-hydrocarbons have attracted global attention as one of the most promising alternative energy products due to its highest similarity to fossil petroleum fuels. Production of these hydrocarbons via decarboxylation of fatty acids represent one of the most important processes. This project is proposed to focus on a newly discovered bacterial P450 fatty acid decarboxylase. Studies on this unique P450 enzyme include systematic enzymology analyses, understanding of its structure-function relationship, and extensive bioengineering via site-directed mutagenesis. Furthermore, combinatorial biosynthesis approaches are to be used to create a novel microbial biosynthetic pathway of bio-hydrocarbon through combining this P450 decarboxylase to another polyketide synthase based hydrocarbon biosynthetic pathway derived from a cyanobacterial species. Globally, this research represents the first example of bioengineering and metabolic engineering of microbial biosynthetic pathway of fatty hydrocarbons.

生物脂肪烃类燃料因其与化石燃料的高度相似性、可再生性、低碳环保等特点成为全球替代能源研究的焦点之一。生物储能物质脂肪酸的脱羧反应是生产烃类替代液体燃料的重要途径。本项目拟对近期发现的一种细菌P450直链饱和脂肪酸脱羧酶进行系统的酶学研究；理解其催化机理与结构功能关系；通过定点突变对其产烃效率进行酶工程优化；并使用组合生物合成手段将该酶与另一来自蓝细菌的聚酮合成酶生物产烃途径进行整合，以获得一条全新的微生物高效产烃生物合成途径。本研究为迄今为止国际上首次对微生物产脂肪烃途径所进行的系统性酶工程与代谢工程改造。

本项目首先利用P450脂肪酸脱羧酶OleTJE纯化蛋白完成了体外催化功能重建、反应条件优化和底物选择性研究；在此基础上完成了OleTJE的酶动力学分析；通过定点突变分析阐明了OleTJE的催化机理和产物调控机制。我们在国际上首次揭示了OleTJE不依赖于过氧化氢辅因子的单加氧酶特性，为利用代谢工程手段构建高效生产脂肪端烯的工程菌指明了新方向。基于新的指导思想，项目组构建的大肠杆菌生物产烃细胞工厂的α烯烃产量（以葡萄糖为原料）为目前国际上已报道最高水平。我们还原创性地设计和构建了基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的“油脂→脂肪酸→α烯烃”人工生物产烃新途径。上述这些结果有力推动了P450脂肪酸脱羧酶这一新酶家族的基础研究，为其未来进入生物能源和生物材料领域的实际应用奠定了重要的理论基础。项目执行期内已发表SCI论文4篇，申请发明专利3项，并产出了丰硕的国际合作交流成果。