刚性b-葡聚糖基基因传递系统的构建及其功能和细胞摄取机制

Safety and efficiency of gene delivery systems are the major challenges in the current gene therapy. b-Glucan has strong self-assembling ability, which can form triple helix or nanofiber-like aggregates via intermolecular hydrogen bonding. Nucleic acid also adopts single helical or double helical structure due to strong hydrogen bonding between bases. Furthermore, not only b-glucan is biocompatible with no cytotoxicity permitted by FDA, but also there are several b-glucan receptors on the surface of various cells, suggesting its active targeting function. A novel gene delivery system will be constructed based on the strong hydrogen bonding between b-glucans and nuleic acid in this project. The CD, micro-DSC, DLS, SLS, and gel electrophoresis and so forth will be utilized to investigate the interaction and the scientific laws that molecular weight and branching degree of b-glucan and the length of homo (poly (nucleotide)) influencing the interaction and the complex stability will be revealed. The gene transfection will be performed in vitro and in vivo, and the transfection efficiency, the effective expression of the related proteins and genes, and the mechanism of cellular uptake will be studied by using microplate reader, western blot, flow cytometry, and laser confocal microscope etc. This project will provide not only an alternative method of constructing gene vectors, but also a novel gene delivery system, indicating an alternative stratege in gene therapy. Therefore, it has important academic values and practical potentials.

基因载体的安全性和效率是目前基因治疗迄待解决的两大关键科学问题。b-葡聚糖有很强的自组装能力，通过分子间氢键形成三螺旋或纳米纤维状聚集体；核酸因碱基间的强氢键作用呈单螺旋或双螺旋结构。b-葡聚糖不仅无毒（被美国FDA认证安全）、生物相容性好，而且多种细胞表面还存在b-葡聚糖受体，因此具有主动靶向功能。本项目基于b-葡聚糖和核酸的强氢键作用拟构建一种新型的基因传递系统，用圆二色谱、微量热DSC、动静态光散射、凝胶电泳等研究它们的相互作用，揭示b-葡聚糖的分子量、支化度、聚核苷酸的序列长度等影响相互作用和复合物稳定性的科学规律；并进行体外和体内基因转染，用酶标仪、蛋白质印迹法、流式细胞仪、激光共聚焦等研究基因转染效率、相关蛋白和基因的有效表达，以及细胞摄取机制。本项目不仅提供了一种新的基因载体构建方法，还构建了一种新型基因传递载体，为基因治疗提供了新的思路，具有重要学术价值和应用前景。

基因载体的安全性和效率是基因治疗亟待解决的重要科学问题。本项目基于β-葡聚糖的独特结构和聚集行为构建了安全性好、效率较高的多糖基载体，并研究了它们对基因、药物、成像试剂等的递送，及其在抗炎症、抗肿瘤、体内成像示踪等方面的功能和细胞摄取机制。取得的重要成果如下：揭示分子量为10-30万的三螺旋香菇β-葡聚糖单链（s-LNT）与碱基长度为50的均聚脱氧核苷酸（poly(dA)）及其衍生物（硫代磷酸化的poly(dA)）的相互作用最强，构建了递送TNF-a的反义寡聚脱氧核苷酸的基因载体系统，并成功用于口服靶向治疗小鼠结肠炎；利用高碘酸钠氧化成功制备了具有酸响应性的香菇β-葡聚糖-阿霉素（LNT-Dox）偶联缀合物，构建了s-LNT-Dox/poly(dA)-fluorophore多功能载体实现对抗肿瘤药物和荧光分子的共递送，用于小鼠活体成像示踪，并显著降低Dox对小鼠的毒副作用；将核酸适配体和阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）引入s-LNT/poly(dA)复合物体系中，有效提高基因的细胞转染效率；发现三螺旋香菇β-葡聚糖在水中聚集形成树枝状纳米纤维和“渔网”结构，由此构建了利用疏水网孔捕获疏水荧光试剂（TPE）的策略，降低成像试剂的毒性，并提高其荧光强度；首次确定黑木耳β-葡聚糖在水中呈三螺旋构象，发现它在水中平行聚集形成树枝状纳米管，由此构建了抗癌药物Dox、成像试剂、硒纳米粒子的载体系统，有效降低Dox的毒副作用和纳米粒子的团聚，提高药物的生物利用度和成像试剂的荧光强度；基于酵母细胞壁结构构建了β-葡聚糖囊泡，用于递送白血病/抗炎的临床用药甲氨蝶呤（MTX），靶向治疗小鼠结肠炎，有效降低了MTX的毒副作用，提高抗炎症疗效；揭示了β-葡聚糖及其载体系统的细胞摄取主要依赖于它们与细胞表面的受体/蛋白之间的相互作用。本项目为新型基因/药物载体的构建提供了新的策略，具有重要的学术价值和应用前景。