膜系留NOTCH1调控口腔鳞状细胞癌增殖及凋亡的实验研究

Excessive cell proliferation and inhibition of apoptosis caused by gene mutations play a key role in the development of malignant tumor. NOTCH1 is an important gene closely related to cancer and development. Our preliminary results displayed NOTCH1 mutation rate in oral squamous cell carcinoma in up to 40 %, and found that most of the mutations are located in the extracellular domain of NOTCH1. Although the mutations located within extracellular domain may inhibit NOTCH1 binding to ligand efficiency and NOTCH classical pathway activation, they may also lead to an increase in the cell membrane expression of NOTCH1 and lead to produce membrane-tethered NOTCH1. Membrane-tethered NOTCH1 was reported to regulate the activity of mTOR, AKT, as well as Wnt pathway. We also found that membrane-tethered NOTCH1 significantly correlated with oral leukoplakia transformation and oral cancer metastasis. This project would firstly detect the membrane-tethered NOTCH1 expression in an animal model of oral squamous cell carcinoma, and then build the membrane-tethered NOTCH1 expressing vector NOTCH1 (V1754L) by site-directed mutagenesis and transfection of oral squamous cell carcinoma cell lines, to study the role of membrane-tethered NOTCH1 in proliferation and apoptosis both in vitro and in vivo and its possible mechanism. Results from this project would provide a new perspective to clarify the role of this non-canonical NOTCH1 pathway in oral squamous cell carcinoma.

基因突变导致的细胞过度增殖以及凋亡抑制与肿瘤的发生密切相关。我们前期研究显示NOTCH1基因在口腔鳞状细胞癌（口腔鳞癌）中的突变率高达40%，且大多数位于胞外段。部分胞外段突变抑制了NOTCH1与配体的结合效率以及经典NOTCH通路的激活，但同时也导致了NOTCH在细胞膜上的表达增加，产生膜系留NOTCH。膜系留NOTCH1可以调控mTOR、AKT、及Wnt等重要通路的活性，同时我们发现膜系留NOTCH1与白斑癌变及鳞癌的转移之间显著相关。本项目拟在前期研究结果的基础上首先通过在口腔鳞癌动物模型上观察膜系留NOTCH1的表达变化，进而通过点突变方法构建膜系留NOTCH1表达载体NOTCH1 (V1754L)，转染口腔鳞癌细胞系，在体外和动物实验两个层面深入研究其对口腔鳞癌增殖及凋亡的影响及其可能的机制。研究结果将从全新的角度阐明膜系留NOTCH1这一非经典NOTCH通路在口腔鳞癌中的作用。

目的：基因突变导致的细胞过度增殖以及凋亡抑制与肿瘤的发生密切相关。我们前期研究显示NOTCH1基因在中国人群头颈鳞癌（HNSCC）中的突变率高达40%，部分胞外段的热点突变（如V1754L）与口腔鳞癌（OSCC）的转移及不良预后相关。本次实验旨在探究膜系留NOTCH1（V1754L）在口腔癌前病变及口腔鳞癌中的作用。.材料与方法：本次实验我们对78个诊断为口腔白斑（OL）的病理标本及正常粘膜组织标本利用免疫组织化学（IHC）方法进行NOTCH1蛋白染色分析，通过生存曲线分析膜系留NOTCH1与口腔鳞癌预后的关系。此外，我们构建了膜系留 NOTCH1 的基因表达载体pcDNA3-NOTCH1V1754L和野生型NOTCH1载体pcDNA3-NOTCH1WT，转染到人口腔鳞癌细胞系中。通过Western blot、RT-qPCR方法检测两组细胞的NOTCH1经典信号通路的激活情况；利用CCK-8实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕等实验，检测细胞功能变化；通过Western blot检测EGFR/AKT信号通路相关分子的表达变化。.结果：本次实验发现在19个转变为口腔鳞癌的白斑标本中膜系留NOTCH1的表达明显增加（p=0.002），且与不良预后有关。免疫荧光结果显示，相比于野生型NOTCH1，转染了pcDNA3- NOTCH1 V1754L后，NOTCH1蛋白表达集中于细胞膜上；Western blot及RT-qPCR结果显示，NOTCH1活化型NICD蛋白表达量明显下降，表明V1754L突变使NOTCH1经典信号通路失活；CCK-8实验等细胞周期检测结果表明，NOTCH1V1754L突变促进了细胞周期的循环，增强了细胞的增殖水平；Transwell侵袭实验、细胞划痕实验表明，实验组细胞的侵袭性、迁移能力增强；EGFR通路广泛激活。.科学意义：我们发现膜系留NOTCH1可以明显促进口腔癌细胞系的增殖及侵袭能力，同时我们发现与经典NOTCH1通路相比，膜系留NOTCH1可通过EGFR/AKT这一非经典途径发挥作用，由此也说明了NOTCH1与EGFR通路间的紧密联系。目前EGFR相关抑制剂虽尚未在口腔癌中批准使用，但这一发现为基因测序联合药物靶向治疗晚期口腔癌提供了新的可能方法。