FSRP1/FSRP3调控鳜鱼肌细胞增殖分化功能和分子机理研究

Follistatin (FS) and follistatin-related protein (FSRP) are involved in several biological functions in vertebrates as well as in fish. Recently, we have first cloned two FSRP isoforms, designated as FSRP1/FSRP3 from muscle tissues of Chinese perch, Siniperca chuatisi. We hypothesize that the two genes (proteins) could play important roles in controlling muscle cell proliferation and differentiation via the PI3K/AKT/mTOR signal transduction regulation in fish. Therefore, we will use Chinese perch as model and apply both forward genetic approaches, such as quantitative and positional express analysis, and in-vivo/in-vitro over-expressions, and reverse genetic approaches by “knockout” FSRP1/FSRP3 with Cas9/iRNA technology in this study. By the two genetic approaches, the effective consequences will be further analyzed via cellular morphology, MTT and Brdu methods and gene expression analyses etc., so as to reveal their possible functions. Furthermore, an in-vitro cell culture systems will also be applied by using P13K inhibitor（LY294002）and mTOR inhibitor (rampmycin) to study whether PI3K/AKT/mTOR signals function in this process. Collectively, these studies will provide significant contribution to the current understanding of muscle development and growth in vertebrates，at least in Chinese mandarin fish and also may provide the technical implications for aquacultural application.

卵泡抑素(FS)和卵泡抑素相关蛋白（FSRP）是一类参与脊椎动物包括鱼类多种生物学功能蛋白。本课题组已首次成功地从鳜鱼肌肉组织中分离克隆FSRP基因的两个同分异构体，即FSRP1和FSRP3。本项目将以鳜鱼为研究对象，采用正向遗传学技术，包括组织特异性表达定量和定位分析，体内/体外过表达，以及反向遗传学技术，如基因敲除等，并综合细胞形态学、MTT和Brdu等生物学技术，分析揭示FSRP1/FSRP3基因调控鱼类肌肉细胞增殖和分化的生物学特征和作用机理；进而，还将采用体外肌细胞培养系统通过添加P13K抑制剂（LY294002）和/或mTOR抑制剂（rampmycin），比较分析对细胞学和相关基因表达的影响，以阐明FSRP1/FSRP3基因调控肌肉细胞增殖和分化过程中的信号转导途或控制网络。其研究结果将为脊椎动物肌肉发育生物学提供新理论，同时为动物养殖包括鱼类养殖提供技术支撑。

本项目以名贵养殖鱼类-鳜鱼为研究对象，已分离克隆了鳜鱼FSRP1和FSRP3 基因cDNA序列（（已提交基因文库，其accession number分别为KM077175.1、和 KM009122.1）。采用生物信息学比较分析FSRP-1与FSRP-3基因结构和同源进化特征；采用qRT-PCR比较分析FSRP-1与FSRP-3基的时刻表达特征，从而推测其基因的可能的生物学功能；构建了FRRP1和FSRP3基因融合载体（FRRP1-和FSRP3-pET32a）, 而后通过采用体外肌细胞培养系统和体内肌肉融合载体或蛋白活体注射，比较分析FSRP-1与FSRP-3过表达对肌细胞增殖分化的影响；该体内注射结果证实，肌细胞增殖速率和肌细胞数量明显增加；进而采用体外肌细胞培养系统，通过在细胞培养基中分别加入P13K抑制剂（LY294002）或mTOR抑制剂（rampmycin）,从而分析推测FRRP1和FSRP3的肌细胞活性的影响；在个体水平上，通过注射抑制剂（LY294002）或mTOR抑制剂（rampmycin）后，采用高通量测序获得了组学水平上表达谱特征以及差异基因以及信号通路的变化（数据任在整理中）。本项目研究从细胞和分子水平研究证实FSRP-1与FSRP-3基因调控鱼类肌肉分化和生长的生物学功能，初步揭示FLRG基因在此调控过程中的信号转导途径或控制网络，其研究结果有望为脊椎动物肌肉发育生物学提供新理论，同时为水产养殖提供技术支撑。.通过本项目的实施，已有发表2篇直接相关SCI论文发表和3篇间接相关论文。待所有数据整理后可发表论文2篇；培养已毕业博士研究生1名，已毕业硕士研究生3名，目前在读博士研究生1名和硕士研究生2名。主办学术会议1次，大会学术报告5次，参加学术会议6人次。