水稻基因组CRISPRa系统的建立及SYM共生通路的激活研究

SYM is a common pathway in plants during rhizobia and AM mycorrhizal infecting. The latest studies revealed that the SYM pathway is activated in establishing symbiosis between the rhizobia and the host legumes; However, the SYM pathways of rice, wheat and other major crops are silenced in interaction with rhizobia. In previous study, we found that the pattern of wheat-rhizobia interaction was similar to that of the leguminous-rhizobia symbiosis, which revealed that the major crops have the potential for nitrogen fixation with rhizobia. Based on the establishment of research system and technical methods in wheat-rhizobia interaction, the CRISPRa of rice genome will be established and improved in this project. In order to wake the silenced SYM pathway, OsSFRMR, OsNFR5, OsCERK1 and other kinases will be activated and edited, co-transfecting exogenous homologous genes of Lotus japonicas will also be implemented. The expression patterns of the key genes and proteins will be determined to reveal the activation of SYM pathway. And then rhizobia will be inoculated to establish the symbiosis with the SYM activated rice, the dynamic distribution and physiological activities of rhizobia will also be detected. The project will help to lay the foundation for preliminary experiment in establishing symbiosis between major crops , such as rice and wheat, and rhizobia.

SYM通路是根瘤菌与AM 菌根入侵植物的共有通路。最新研究揭示豆科SYM通路在与根瘤菌共生中被激活；水稻、小麦等主要农作物SYM通路在与根瘤菌互作中却被沉默。本团队研究发现小麦-根瘤菌互作模式与豆科-根瘤菌共生模式相近，揭示主要农作物具有与根瘤菌共生结瘤固氮潜能。本项目拟基于前期建立的小麦与根瘤菌研究体系与技术方法，建立和完善模式作物水稻基因组CRISPRa激活体系，通过激活和编辑水稻SYM通路中菌植识别相关类受体激酶OsSYMRK, OsNFR5, OsCERK1及其互作激酶基因，并行将豆科模式生物百脉根同源SYMRK-NFR5-NFR1共同转入水稻，从内源和外源基因角度激活SYM通路；测定该通路关键基因与蛋白的表达模式，揭示SYM通路的激活情况；进而接种根瘤菌研究激活SYM通路水稻的共生结瘤状况，检测根瘤菌的动态分布与生理活性，为水稻、小麦等主要农作物与根瘤菌共生结瘤奠定前期试验基础。

本项目前期研究发现水稻等非豆科作物具有与根瘤菌共生固氮的潜能。本项目主要研究内容与结果如下：①. 建立和优化了水稻基因组高保真CRISPRa激活系统，利用该系统在原生质体水平使OsGW7基因被激活95倍，稍高于最新文献报导中该基因的激活倍数，表明本项目建立的高保真CRISPRa激活系统可用于水稻内源基因的激活研究。②. 亚细胞定位结果表明OsNFR5、OsCERK1和OsSYMRK均定位于质膜，该结果与生物信息分析预测结果一致。分子进化分析结果揭示水稻结瘤因子受体OsNFR5/OsMYR1、OsCERK1和共生受体激酶OsSYMRK与豆科同源蛋白之间亲缘关系较近。表明可利用本项目建立的CRISPRa激活系统进行水稻与根瘤菌共生固氮探索研究。③. 利用该高保真CRISPRa激活系统在原生质体水平使水稻结瘤因子受体基因OsNFR5、OsCERK1与共生受体激酶基因OsSYMRK实现不同程度激活；进一步利用该激活系统使水稻SYM共生通路关键基因OsCCaMK与AM菌根共生Marker基因OsAM1、OsAM3也得到激活。④. 明确了低浓度的生长素类似物2,4-D 可诱导水稻幼苗产生类根瘤，后续可与本项目建立的CRISPRa激活系统相结合，通过外源与内源协作为水稻与根瘤菌共生固氮探索新方案。⑤. 建立了茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS571基因组CRISPR/Cas9精准编辑体系。利用该体系揭示了茎瘤固氮根瘤菌中AZC_2928基因的生物学功能，为利用该体系精准创制适合水稻等非豆科作物共生固氮的根瘤菌优良菌株奠定前期试验基础。.本项目建立的水稻基因组高保真CRISPRa激活系统不仅可用于水稻内源基因的激活，亦可用于小麦、玉米等作物的内源基因激活，有望为作物性状改良与分子设计育种提供新的技术方案。本项目建立的茎瘤固氮根瘤菌A.caulinodans ORS571基因组CRISPR/Cas9精准编辑体系，也可适用于对其他根瘤菌进行精准遗传改造，为后续精准改良菌植双方探索水稻等非豆科作物共生固氮奠定前期技术基础。