单宁酸抗奶牛氧化应激分子机制研究

The use of antioxidants to alleviate the oxidative stress and its mechanism of action has become a current research focus because oxidative stress is a major problem in the dairy farming industry.This study evaluate the effect of tannins on growth performance, the content of cortisol and antioxidant enzyme activity in the transition cow and the optimum content of tannins in feedstuff. Using oxidative stressed cow liver cell induced by diquat, this study observe the effect of tannins on gene expression, protein expression, protein localization and protein degradation of Nrf2 by RT-PCR, Western-blotting and immunofluorescence staining techniques. Finally, this study detect the expression of Nrf2 protein using the particular pathway inhibitor and choose the signal pathway in MAPKs signal system in which Nrf2 plays a key role. This study explore the molecular mechanism of tannins on alleviating oxidative stress in cows by the combination of animal experiment and cell culture. this study provide a theoreticl basis of the tannins as a natural antioxidant in animal production.

氧化应激一直是困扰奶牛饲养的一大难题，利用抗氧化剂缓解奶牛氧化应激及其作用机理已成为当前的研究热点。本项目以围产期奶牛为实验对象，单宁酸为氧化应激调控剂，通过测定皮质醇激素含量和抗氧化酶活性的变化，研究单宁酸对奶牛机体氧化还原状态的影响。结合单宁酸对奶牛生产性能和健康状况的影响，确定其适宜添加量。然后，选取敌草快诱导的奶牛肝细胞氧化应激模型，利用实时荧光定量PCR、Western-blotting和免疫荧光染色技术研究单宁酸对Nrf2的基因表达量、蛋白表达量、蛋白定位以及蛋白降解的影响。最后，利用特殊性通路抑制剂，通过检测核内Nrf2蛋白表达量，筛选MAPKs信号系统中对单宁酸影响Nrf2起关键作用的信号通路。本研究通过动物实验和细胞培养相结合的方法，探讨单宁酸抗奶牛氧化应激的分子机制，为单宁酸作为一种天然抗氧化剂在畜牧生产中的应用提供理论依据。

氧化应激一直是困扰奶牛饲养的一大难题，如何应用抗氧化剂来维持机体氧化还原系统的平衡，减少氧化应激对奶牛生产造成的危害已成为当前的研究热点之一。单宁酸是一种多酚化合物，是植物代谢过程中产生的一种次生物质，具有良好的抗氧化特性。但到目前为止，关于单宁酸作为抗氧化剂在奶牛生产中的应用效果以及调控动物机体抗氧化酶基因表达的作用机理还尚不清楚。且该效应在动物体内是否是通过调控MAPK-Nrf2-ARE通路完成，还需要进一步研究证实。此外，调控MAPK-Nrf2-ARE通路的途径有很多，然而目前的研究主要集中在对通路蛋白转录水平的调控，对核与质的转移以及翻译水平的调控研究没有报道。本研究首先通过比较不同生理阶段奶牛的机体氧化还原状态和氧化损伤确定围产期奶牛遭受了严重的氧化应激及其损失，在围产期奶牛日粮中添加抗氧化剂可能有效缓解氧化损伤，避免以后氧化应激类疾病的发生。通过在围产期奶牛日粮中添加具有抗氧化特性的栗树单宁可以有效缓解奶牛血液、肝脏和乳腺组织的氧化应激状态，减少乳腺组织的炎症反应，提高奶品质，并且当添加剂量为10g/kg DM时对奶牛的生产性能并无不良影响。通过检测相关抗氧化酶基因表达量我们发现栗树单宁的抗氧化应激的作用机制可能是提高动物机体内源性抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶）的基因表达量来完成的。此外通过利用过氧化氢诱导的牛肾脏细胞氧化应激模型研究了单宁酸对Nrf2-ARE信号通路的影响，结果发现单宁酸可以显著提高细胞中Nrf2的基因表达量，证明了单宁酸对氧化应激状态的牛内源性抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性的提高是通过作用于Nrf2-ARE信号通路来完成的。最后通过筛选MAPK通路及检测MEK3和MEK4基因表达量后发现单宁酸下调了MEK3和MEK4基因的表达量，并且抑制p38MAPK和JNK通路后，单宁酸对SOD和GSH-Px的基因表达无明显促进作用。结果说明单宁酸主要是通过调控p38MAPK和JNK信号通路来缓解氧化应激对奶牛所产生的氧化损伤。综上所述，单宁酸可以有效缓解氧化应激对奶牛造成的氧化损伤，并揭示了该作用是通过p38MAPK和JNK-Nrf2-ARE信号通路调控内源性抗氧化酶的活性来完成的，为单宁酸作为一种天然抗氧化剂在畜牧生产中的应用提供了理论依据。