基于定量蛋白组学的中国特有种-沙芥对干旱胁迫的响应机制及耐旱基因鉴定

Pugionium cornutum(L.)Gaertn belong to Cruciferae vegetable,it is chinese endemic species and type species of Pugionium,mainly distributed in the duneland of Hunshandake,Kubuqi Maowusu.Pugionium cornutum(L.) Gaertn is a multifunction sand plant used as vegetable,medicine,feed and sand fixation.The project will chooses Pugionium cornutum(L.) Gaertn seedling leaf as material,apply quantitative proteomic technology to analyze the proteome expression of Pugionium cornutum(L.) Gaertn under drought stress and find differentially expressed proteins under drought stress.The KEGG pathway and GO annotation of the differently expressed proteins of root are performed. Futhermore,correlation analysis of transcriptomic and proteomic of root are performed to screen drought tolerance–related genes,then genes are cloned and verified.The study aim at revealing responding molecular mechanism of Pugionium cornutum(L.)Gaertn seedling under drought stress.The project will helpful for understanding resistance-drought mechanism of Pugionium cornutum(L.),and provide candidate genes for plant gene engineering and plant gene breeding.

沙芥是中国特有种，主要分布于蒙古高原的浑善达克、库布齐、毛乌素沙地，是典型的沙生植物。沙芥是一种集菜用、药用、饲用、防风固沙为一体的多功能沙生植物，但其耐旱的分子机制研究较少。该课题以沙芥幼苗叶片为材料，在人工模拟土壤干旱胁迫的条件下，利用定量蛋白组学技术，获得叶片的差异蛋白，并对差异蛋白进行KEGG和GO注释，明确差异蛋白富集的代谢通路和功能，鉴定出差异蛋白的种类和功能。同时，结合前期的转录组数据进行关联分析，筛选出耐旱的候选基因并进行功能鉴定。该课题研究不仅有助于解析沙芥幼苗对干旱胁迫响应的分子机制，而且也可为进一步开展植物抗旱基因工程研究，培育抗旱植物新品种提供候选基因。

本研究以沙芥幼苗叶片为材料，在人工模拟土壤干旱胁迫的条件下，利用定量蛋白组学技术，结合前期转录组数据进行关联分析，筛选出耐旱的候选基因并进行功能鉴定。该研究不仅有助于解析沙芥幼苗对干旱胁迫响应的分子机制，而且也可为进一步开展植物抗旱基因工程研究，培育抗旱植物新品种提供候选基因。.通过蛋白组分析可知，在中度和重度胁迫中分别鉴定出196个(上调107个，下调89个)和489个(上调230个，下调259个)差异蛋白（DPs）。有77个和74个DPs在上调和下调共表达。DPs显著富集于氨基酸合成代谢、硫代葡萄苷合成等途径。在中度和重度胁迫中蛋白组和转录组关联分析表明，相关系数分别为0.657和0.789，有30个(中度)和70个（重度）DPs在转录组和蛋白组水平上共同调控，其中24个和61个表现出相同的趋势，说明这些蛋白主要是由相应的基因表达变化而调控。在中度和重度胁迫中，有7个DPs属于热休克蛋白(heat shock protein, HSPs)，应用qRT-PCR技术对于筛选出的7个热激蛋白差异基因进行了验证，其中有6个热激蛋白差异基因的表达趋势与其对应蛋白的表达趋势相同，4个极显著上调，表明这4个热激蛋白基因可能对于沙芥耐旱性起到关键作用。通过同源克隆技术，对4个热激蛋白基因CDS进行全长克隆，4个基因的全长CDS序列的编码区分别为462bp、699bp、477bp、1944bp，分别编码153个、232个、158个、647个氨基酸；通过Blast比对，发现这些片段分别为小热激蛋白家族和热激蛋白70家族基因，根据预测蛋白相对分子质量的大小，分别命名为PcHSP17.8、PcHSP26.5、PcHSP18.1、PcHSP70，对这些基因的特征和系统进化关系进行了分析。采用qPCR技术分析基因的表达模式表明4个热激蛋白基因在根、叶中的表达具有组织特异性，并受高温、低温、干旱、盐和ABA等处理诱导。亚细胞定位观察发现基因定位在细胞质细胞核中。过表达4个基因的拟南芥种子在甘露醇胁迫下萌发率无显著差异，但过表达pGanG-HA-PcHSP18.1、pGanG-HA-PcHSP70的拟南芥种子萌发后主根长于野生型，且在幼苗生长阶段抗旱性强于野生型拟南芥。